离体筛选彩叶凤梨耐羟脯氨酸变异体的研究

崔克强，王彦尊，史华平，王计平

（1.山西省农业科学院果树研究所，山西 太谷 030800；2.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801）

彩叶凤梨（Neoregelia caroline）原产于南美热带地区，花期长达3个月，可在室内常年种植，是近年来非常流行的室内盆花之一[1]，适宜在疏松、肥沃的土壤中生长，但耐寒性较差。随着组织培养技术在农业上的广泛应用，目前利用化学诱变技术与离体培养相结合筛选抗性突变体的研究越来越受到人们的重视，已在茄子[2]、紫花苜蓿[3]、小麦[4]、草莓[5]、猕猴桃[6]、杨树[7]等植物中筛选到抗性突变体。

烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）是常用化学诱变剂中效率高且负面影响较小的诱变剂，能够引起单一碱基对发生改变而形成点突变，应用广泛，突变体表现出的性状多为显性性状，易于筛选，可以为种质创新、新品种培育及功能基因组研究分析提供大量基础材料[8-11]，而且大量研究表明，在化学诱变过程中，以羟脯氨酸作为选择压力进行定向筛选，以提高植物体内脯氨酸含量，可以获得抗性较强的突变体材料[3，12]。

本试验利用组织培养技术对彩叶凤梨单株试管苗进行EMS诱变及抗羟脯氨酸（L-HYP）筛选，进而定向筛选获得抗寒性强的彩叶凤梨变异体，为彩叶凤梨的抗性育种提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以株高2 cm左右、长势大致相同的彩叶凤梨单株试管苗为材料，进行EMS诱变处理及抗寒突变体的筛选及鉴定。

试验所用继代培养基为MS＋KT4.0 mg/L＋IAA 0.5 mg/L，添加琼脂6 g/L，蔗糖30 g/L，调节pH值为5.8～6.0；试验所需光照强度为2 000～3 000 lx，光照时间为14 h/d，培养温度均为（25±2）℃。

1.2 试验方法

试验于2015—2016年在山西农业大学农学院植物组织培养实验室进行。用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液配制不同体积分数EMS溶液，过滤灭菌，EMS溶液体积分数分别为0.1%，0.3%，0.5%，0.75%，1.0%，以不含EMS的磷酸缓冲液处理为对照。取预培养30 d的单株试管苗，用不同体积分数EMS 溶液分别浸泡 4，6，10，24 h 后，硫代硫酸钠冲洗若干次，再用无菌水冲洗后，接种于继代培养基中恢复生长、促进分化。存活率＝（存活试管苗数/处理试管苗总数）×100%；分化率＝（分化不定芽的试管苗数/处理试管苗总数）×100%。

将半致死剂量存活的试管苗进行继代培养，经5，6，7 mmol/L的羟脯氨酸（HYP）逐级筛选后进行4℃低温胁迫处理4 h，分别测定叶片的电导率、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性等生理生化指标，以正常继代培养的试管苗作为对照，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变处理对彩叶凤梨试管苗存活率的影响

表1 EMS诱变处理对彩叶凤梨试管苗存活率的影响

由表1可知，不同体积分数EMS处理相同时间，随着处理体积分数的增加，试管苗的存活率逐渐降低；而相同体积分数EMS处理时，随着处理时间的延长，试管苗的存活率也逐渐降低。将预培养30 d的试管苗用EMS处理6 h，处理体积分数为0.1%～1.0%时的存活率分别为 60.0%，53.3%，48.4%，41.9%，12.9%，存活植株较多；EMS体积分数为1.0%时，单株存活率明显下降；在EMS体积分数为0.5%，处理时间为6 h时，试管苗存活率为48.4%，可以作为半致死剂量，为了避免高体积分数EMS处理对试管苗造成太大的伤害，继而导致试管苗生长受到抑制，EMS使用浓度以不超过0.75%为佳，故选用0.5%EMS处理彩叶凤梨试管苗。

2.2 EMS诱变处理对彩叶凤梨试管苗分化的影响

将预培养30 d的试管苗经EMS诱变处理后接种在继代培养基上，以未经诱变处理的试管苗作为对照。从表2可以看出，彩叶凤梨试管苗的平均分化率随着EMS使用体积分数及作用时间的增加呈下降趋势。在EMS体积分数为0.5%，处理时间6 h时，试管苗的不定芽分化率为36.9%。

表2 EMS诱变处理对彩叶凤梨试管苗分化的影响

2.3 突变体筛选

由表3可知，0.5%EMS诱变处理6 h后的试管苗继代培养30 d，经不同体积分数羟脯氨酸（HYP）逐级筛选后，发现对照组的不定芽在5 mmol/L的HYP处理下仍然有62.5%的试管苗存活，当处理浓度为6，7 mmol/L时，不定芽存活率均小于50%；将7 mmol/L处理下存活的植株继续在相同浓度HYP处理下继代培养，发现试管苗全部死亡；而处理组试管苗在不同浓度HYP筛选时存活植株数基本都超过50%，当7 mmol/LHYP处理时，试管苗存活率为46.1%，接近于50%，故选择浓度7 mmol/L为耐HYP突变体的半致死剂量（表3）。将7 mmol/L浓度HYP处理下存活的试管苗接种到含有相同浓度HYP的培养基中培养30 d，仍然有10株存活，将存活下来的试管苗进行连续继代培养3次，用于进行突变体的鉴定。

表3 HYP筛选对试管苗存活率的影响

2.4 突变体鉴定

2.4.1 EMS诱变及HYP筛选对继代苗叶片电导率的影响 通过测定彩叶凤梨突变体植株的电导率（以正常生长的彩叶凤梨试管苗为对照），研究在4℃低温胁迫下植株细胞膜受伤害程度。由表4可知，在4℃低温胁迫后电导率会增加，相比对照组，经过HYP筛选存活下来的试管苗，电导率增加幅度较小，说明诱变株细胞膜受伤害程度较小，初步证明其具有较强的抗寒能力。

表4 低温胁迫对叶片电导率的影响 %

2.4.2 EMS诱变及HYP筛选对继代苗保护酶活性的影响 由表5可知，经过EMS诱变与HYP筛选的试管苗，在受到低温胁迫后，植株体内产生的SOD含量是对照植株的1.5倍，POD则是对照植株的1.34倍，表明通过EMS诱变处理及HYP筛选能够提高彩叶凤梨试管苗SOD，POD的活性，这进一步说明经过EMS诱变处理后，彩叶凤梨试管苗抗寒能力有所提高。

表5 低温胁迫对保护酶活性的影响

3 结论与讨论

EMS化学诱变产生点突变的频率较高，染色体畸变较少，可以对植物的某种特殊性状进行改良，是目前应用最广泛、效果最好的一种化学诱变剂[13]。但EMS在诱变的同时会造成生理损伤，一定范围内，随着处理浓度和处理时间的提高，突变效率增加，生理损伤同时也会增大，所以，合适的浓度范围是诱变成功的关键，一般使用半致死剂量作为最佳处理浓度[8]。本研究选用0.5%的EMS处理6 h时，存活率为48.4%，接近50%，且处理后试管苗的分化率为36.9%，是比较合适的诱变组合。EMS诱变对象多为种子[14-15]，但近年来，随着组织培养技术的应用，利用诱变与组织培养相结合的方式创造新种质的研究已经获得了很大的成功[4-6]。本研究采用彩叶凤梨试管苗进行EMS诱变处理，获得了抗寒突变体。

羟脯氨酸是脯氨酸的类似物，在诱导突变体时，采用在培养基中添加羟脯氨酸的间接筛选法，可以获得抗性较强的突变体植株。曹必好等[16]用60Coγ-射线诱变与高浓度羟脯氨酸离体选择相结合的方法，获得了甘蓝抗性变异体再生植株；李红等[3]利用组织培养技术对紫花苜蓿愈伤组织进行叠氮化钠（NaN3）诱变及抗羟脯氨酸（L-HYP）筛选，获得抗性强的紫花苜蓿愈伤组织。本研究采用7 mmol/LHYP筛选突变体，获得了彩叶凤梨抗羟脯氨酸的试管苗，并再生培养成抗性植株。

植物在受到逆境胁迫后，体内活性氧的产生与消除的动态平衡遭到破坏，活性氧含量增加，加剧了膜脂过氧化作用，从而破坏细胞膜结构，SOD可以清除细胞内超氧阴离子，使其转变为H2O2；POD则可以将转变为O2，清除活性氧对细胞的毒害作用，保护植株抵抗逆境胁迫。本研究对筛选获得的突变体植株进行4℃低温胁迫处理，结果表明，突变体植株的电导率明显低于对照，SOD，POD活性显著高于对照，说明通过EMS诱变及HYP筛选获得了诱变植株，且其抗寒能力显著提高。