14-3-3η对类风湿关节炎的诊断价值及其与骨代谢的相关性分析

曾婷婷，谭立明，田永建，余建林，吴洋，蒋永清

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种临床常见的自身免疫性疾病，以小关节滑膜炎症起病，病因尚未明确[1]。RA病程进展到后期可导致局部或全身性骨质破坏。患者出现关节功能损伤或骨质疏松等并发症[2]。14-3-3η蛋白已被报道在RA患者血清中水平升高，且与RA骨质破坏相关[3-4]，但其具体机制尚未阐明。本研究通过测定血清14-3-3η、类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrulline polypeptide antibody，anti-CCP)及骨代谢相关指标水平，评估14-3-3η对RA的临床诊断价值，并分析其与RA患者骨代谢指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2016年9月－2017年12月南昌大学第二附属医院收治的113例RA、40例骨性关节炎(osteoarthritis，OA)和37例强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者以及该院同期健康体检者77例。RA患者为RA组，诊断符合2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)/欧洲抗风湿联盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)RA诊断及分类标准[5]。OA及AS患者为非RA(non-RA)组，患者诊断均符合相关指南[6-7]，并伴有明显小关节痛。77例健康体检患者为健康对照组。受试者血清标本由南昌大学第二附属医院生物样本库提供。所有标本均在患者知情条件下获得，并经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准许可。

1.2 纳入及排除标准 符合条件者予以纳入：①自愿参与研究，签署知情同意书；②临床诊断明确，临床资料翔实；③OA及AS患者有明显的小关节疼痛表现；④资料经重新评估，不合并其他自身免疫性疾病、骨质疏松和(或)骨肿瘤等系统性骨病及其他各系统严重合并症；⑤采血前2个月内未发生骨折及服用各种影响骨代谢指标检测的药物；⑥健康体检者各项常规指标检测无异常。排除标准：①合并严重的肝、肾、心或肺等系统疾病，内分泌或免疫系统紊乱；②妊娠或哺乳期妇女及生长发育期儿童。

1.3 试剂及方法 患者资料由南昌大学第二附属医院病例系统收集，包括患者性别、年龄、病程、晨僵时间、压痛和(或)肿胀关节数量、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)及红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)检查结果等。采用ELISA检测所有研究对象血清14-3-3η蛋白及anti-CCP水平，试剂分别购自武汉华美生物工程有限公司(武汉，中国)和科新生物科技股份有限公司(上海，中国)。血清RF水平通过速率散射比浊法测定，采用的IMMAGE 800全自动特定蛋白分析系统及配套试剂购自美国贝克曼库尔特有限公司。RA患者血清骨钙素(osteocalcin，OC)、25羟维生素D[25-hydroxy vitamin D，25-(OH)D]、甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)、Ⅰ型胶原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of type I collagen，PINP)和β-胶原降解产物(β-crosslaps，β-CTx)采用cobas e601全自动电化学发光仪及配套试剂检测，仪器及试剂购自罗氏诊断产品有限公司(上海，中国)。骨碱性磷酸酶通过凝集素亲合法手工测定，试剂由中生金域诊断技术有限公司(北京，中国)提供。实验室检测操作均严格遵照所用试剂操作说明书及南昌大学第二附属医院标准作业程序(SOP)文件进行，所有标本重复检测2次，批间及批内误差均＜5%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用Kolmogorov-Smirnov检验和Levene's检验分析计量资料数据正态性和方差齐性；正态分布资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；偏态分布以[M(Q)]表示，组间水平差异采用非参数Kruskal-Wallis检验，进一步两两比较采用Nemenyi检验；绘制受试者工作曲线(ROC)，通过曲线下面积(AUC)评估并比较各指标诊断RA的价值，通过logistic回归模型建立2个或多个指标联合，比较诊断价值；各实验室检测指标间相关性采用Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 受试对象人口学特征及实验室检测结果的比较 所有研究对象人口学特征及血清RF、anti-CCP和14-3-3η检测结果如表1所示。各组性别及年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。经Kruskal-Wallis及事后Nemenyi检验分析，RA组血清RF、anti-CCP和14-3-3η水平明显高于non-RA组和健康对照组(P＜0.01)，且non-RA组RF和14-3-3η水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 14-3-3η单独或联合RF和(或)anti-CCP对RA的诊断价值 ROC曲线结果分析显示，14-3-3η、RF和anti-CCP诊断RA的AUC分别为0.845，0.807和0.878，3个指标两两联合或3个指标联合可提高诊断价值(图1)。在2.60ng/ml截断点时，14-3-3η诊断RA的敏感性和特异性分别为62.83%和92.21%。

2.3 不同14-3-3η水平组RA患者实验室检查结果比较 根据ROC曲线分析结果，选取2.6ng/ml为截断点将RA患者根据血清14-3-3η水平分为3组：＜2.6ng/ml组(n=43)，2.6～5.0ng/ml组(n=43)和＞5.0ng/ml组(n=27)。结果显示，3组RA患者RF、anti-CCP、CRP、ESR、28关节活动度评分(28 joint disease activity score，DAS28)及PINP、β-CTx和OC等骨代谢指标中仅PINP和β-CTx在3组间差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

2.4 RA患者实验室检测指标相关性分析 对113例RA患者所有实验室检测指标进行Pearson相关性分析，血清RF水平与anti-CCP水平相关系数(r)为0.732(P＜0.001)，14-3-3η与PINP及β-CTx强相关，r分别为0.817和0.808(P＜0.001，表3)。

表1 各组受试对象人口学特征及实验室检测结果比较Tab.1 Demographics and laboratory results of subjects in each group

图1 14-3-3η、RF、anti-CCP及其联合诊断RA的ROC曲线Fig.1 ROC curve of 14-3-3η,Rheumatoid facto,anti-CCP and their combination for Rheumatoid arthritis diagnosis AUC.Area under curve; RF.Rheumatoid factor; anti-CCP.Anti-cyclic citrulline polypeptide antibody

表2 不同14-3-3η水平组RA患者血清检测结果比较Tab.2 Comparison of serum test results among RA patients with different serum levels of 14-3-3η protein

表3 RA患者血清学指标相关性分析(r)Tab.3 Correlation analysis of serum indices in patients with RA (r)

3 讨 论

RA疾病管理的关键在于早期诊断并及时进行合理治疗，延缓疾病进程[8]。目前，影像学检查及血清学检测RF和anti-CCP结合临床表现是临床诊断RA的主要手段[9]，但仍有部分症状不典型及血清学阴性的患者由于误诊或漏诊而延误治疗[1]。14-3-3η已被证实在RA患者血清和关节滑液中明显升高，对其诊断及鉴别诊断具有一定价值。Maksymowych等[10]的一项研究发现，血清14-3-3η水平(ng/ml)在早期RA组(0.76ng/ml)和非早期RA组(1.12ng/ml)均明显高于健康人群(0.00ng/ml)和疾病对照组(0.02ng/ml)。ROC曲线分析结果显示，选取≥0.19ng/ml为截断点时，非早期RA组与健康对照相比，AUC为0.89(95%CI 0.85～0.93)，敏感性和特异性分别为77.0%和92.6%，将非早期RA患者与所有对照人群(健康人群及疾病对照人群)对比，14-3-3η诊断RA的敏感性和特异性分别为77.4%和86.0%。本研究结果显示，血清14-3-3η蛋白水平在RA组(3.26ng/ml)明显升高(P＜0.05)，且非RA组(1.84ng/ml)也明显高于健康对照组(0.27ng/ml)，差异有统计学意义(P＜0.05)。说明炎性关节病变尤其是RA患者血清14-3-3η蛋白水平确有升高，可能与疾病的发生有关；经ROC曲线分析，14-3-3η诊断RA的AUC为0.845(0.797～0.893)，诊断价值高于RF[0.807(0.751～0.862)]，而略低于anti-CCP[(0.878(0.830～0.926)]。当截断值为2.60ng/ml时，14-3-3η对RA诊断的敏感性和特异性分别为62.83%和92.21%。以上结论与国内外研究结论基本一致[10-12]，血清14-3-3η水平略有差异，可能由试剂盒差异所致。RF和anti-CCP是临床常用于RA诊断和分类的生物标记物。本研究随后评估了联合14-3-3η、RF和(或)anti-CCP后对RA的诊断价值。结果显示，3项指标两两联合或3者联合后诊断RA的AUC均变大，3项指标联合后AUC最大为0.907，而14-3-3η联合anti-CCP的AUC甚至超过临床常用的RF与anti-CCP联合(0.900vs.0.875)，与Maksymowych等[10]的结论基本一致。Carrier等[13]的研究表明，高水平14-3-3η联合自身抗体阳性结果能够增加RA的检出率，该研究中增加的24例至少一项指标阳性的患者中，有20例虽然自身抗体检测结果为阴性，但是已经达到1978或2010年制定的RA诊断与分类标准，说明14-3-3η蛋白水平对RA患者的诊断确实具有一定的价值，尤其可以减少血清学阴性患者的漏诊和误诊。

RA通常表现为对称性小关节慢性炎症，随着疾病进展突破关节滑膜、侵蚀关节软骨及骨质，患者晚期可出现关节畸形和功能受损[14]。此外，RA还是发生继发性骨质疏松(osteoporosis，OP)的重要原因[15-16]，发展为OP的RA患者极易发生骨折甚至导致患者残疾[17]。14-3-3蛋白是一个高度保守的酸性蛋白家族，结构上的两性凹槽使得该蛋白能与胞内200多种配体蛋白结合[18-19]，在多种生命活动调节和疾病发生发展中发挥重要作用，功能涉及细胞周期调控、转录调控、信号转导、生长与黏附、凋亡、免疫炎症、肿瘤发生等。本研究通过对比不同14-3-3η蛋白浓度RA患者的骨代谢指标水平探讨14-3-3η与RA患者骨代谢水平的关系，发现PINP和β-CTx在高14-3-3η组明显高于低水平组，且经Pearson相关分析PINP和β-CTx与14-3-3η高度相关(r分别为0.817和0.808)。PINP和β-CTx是常用的骨代谢指标，用于指示机体骨质破坏及修复状态[20-21]。PINP是胶原合成及转化过程中前胶原分子氨基末端分解产物，能反映Ⅰ型胶原代谢状态；而β-CTx是Ⅰ型胶原分解产物，是反映骨吸收的重要标志物，提示14-3-3η可能与RA患者骨代谢状态相关，高14-3-3η蛋白水平患者可能更易发生骨代谢紊乱和骨质疏松。Maksymowych等[4]研究证实14-3-3η能剂量依赖性地诱导与RA直接相关的炎性因子如：白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-9和核因子-κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达，且与RA关节损伤有关，但其具体机制未知。此外，多种MMPs已经被证实参与关节软骨基质降解和关节软骨及骨质退变，进而参与如OA和RA等多种疾病的发生发展[22-23]。以上证据表明14-3-3η可能通过诱导MMPs高表达进而降解胶原成分，对关节软骨及骨质造成损伤，甚至改变患者全身骨代谢状态，而其具体机制尚待进一步研究证实。CRP、ESR及DAS28是反映RA患者疾病活动度的常用指标，本研究未发现14-3-3η水平与三者相关，提示14-3-3η可能不是反映疾病活动度的良好指标。

综上所述，血清14-3-3η蛋白检测对RA的诊断鉴别具有临床价值，并且联合RF和(或)anti-CCP检测可提高RA诊断效能。此外，14-3-3η蛋白血清水平与RA患者骨代谢水平存在关联，可作为RA辅助诊断和病情监测的参考指标。