复方地黄颗粒对阴虚动风证帕金森病异动症模型大鼠神经行为学的影响

梁建庆，何建成

左旋多巴诱发异动症(levodopa-induced dykinesias，LID)是帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者常见的药物并发症。研究发现，经左旋多巴(levodopa)治疗4～6年后，约40%的PD患者会出现LID[1]，可不同程度地影响PD患者的日常生活，严重时具有致残性。本课题组前期动物实验及临床研究发现，复方地黄颗粒治疗PD有效[2]。基于此，本研究拟建立LID大鼠模型，探讨复方地黄颗粒对其神经行为学的影响，为中药新药的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及条件 SPF级雄性SD大鼠，体重180～200g，由上海中医药大学实验动物中心提供[许可证号：SYXK(沪)2012-0002]。饲养环境：恒温(23±2)℃，自动光-暗控制(7:00～19:00光照，19:00～7:00暗置)，相对湿度60%～65%，自由摄食、饮水。

1.2 主要试剂与仪器 6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA，批号：MKBP0832V)、阿扑吗啡(apomorphine，APO，批号：SLBF6369V)、抗坏血酸(批号：063K1082)、左旋多巴干粉(批号：192K1885)、苄丝肼(批号：B22851)为美国Sigma公司产品；戊巴比妥钠(批号：WS20130112)为上海中西药业股份有限公司产品；庆大霉素(批号：20130675)为上海第一制药厂产品，0.3g/支。RWD-68003型大鼠脑立体定位仪为深圳瑞沃德生命科技有限公司产品。

委托国家中药制药工程技术研究中心制备复方地黄颗粒。处方：熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母、丹参、石菖蒲、全蝎，共45.6kg(上海中医药大学提供)。制法：以上七味药物浸液过滤后减压浓缩成相对密度1.30(60℃)的清膏，减压干燥，粉碎；以淀粉与糊精的等比混合物为辅料，浸膏粉与辅料比为2:1，一步制粒。大鼠中药的每日用量，按孙瑞元教授建立的标准体重大鼠每日用量方法计算[3]。

1.3 阴虚动风证PD大鼠LID模型的制备、分组与给药 阴虚动风证PD模型以6-OHDA诱导，采用Ungerstedt[4]建立并经本课题组反复验证的二点法进行构建[5-6]。造模前常规测试神经行为学表现，确认大鼠无异常旋转行为；造模10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg诱发大鼠向健侧旋转，记录开始旋转后30min内的旋转圈数，以旋转圈数平均＞7次/min者为合格的PD模型[7]。PD模型大鼠给予腹腔注射左旋多巴/苄丝肼(50mg/kg左旋多巴和12.5mg/kg苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水中)，每日2次，连续2周；异常不自主动作(abnormal involuntary movement，AIM)评分20，且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者，为成功的阴虚动风证LID模型[8](图1)。

图1 帕金森病LID动物模型制备Fig.1 Levodopa-induced dyskinesia of Parkinson's disease model rats

采用区层随机法，将造模成功的LID模型大鼠随机分为模型组(Model组)和复方地黄颗粒组(CRG组)，每组10只；根据课题组前期预实验结果，复方地黄颗粒组给予中药复方地黄颗粒(14g/kg，2ml)灌胃，模型组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续用药6周。另设正常组(NC组)和假手术组(SO组)，每组10只；正常组除捆绑外不作其他处理，假手术组构建PD模型时脑内注射0.2%抗坏血酸水溶液，继而腹腔注射含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水，2周后给予生理盐水2ml灌胃。实验动物于给药4周、6周两个时间点进行神经行为学评定。

1.4 阴虚动风证LID大鼠神经行为学观察 LID大鼠模型的行为学观察内容主要包括AIM评分及对侧旋转行为的评定，并进行APO诱导LID大鼠对侧旋转行为的评定。

1.4.1 LID大鼠行为学观察与AIM评分 于复方地黄颗粒给药第4、6周对大鼠进行AIM评分。用药后每间隔35min评定1次，连续评定4组数据，持续140min，4次评分之和为最终得分[9]。主要行为学定义及赋分如下：

(1)肢体运动障碍：损毁对侧前肢重复、节律性的反射运动或肌肉运动障碍。

0分：无；1分：逐渐出现的可辨别的对侧前肢反射运动；2分：间歇性高频率的对侧前肢运动；3分：持续性高频率的肌肉运动，刺激可使之停止；4分：持续性高频率的肌肉运动，刺激无法使之停止。

(2)轴性运动：头部及躯体朝向损毁侧的侧屈及轴性旋转。

0分：无；1分：以两足站立时躯体经常性向对侧旋转；2分：以两足站立时躯体经常性向对侧旋转同时伴有间歇性头颈侧屈；3分：持续头颈及躯干对侧旋转，但仍可保持平衡；4分：头颈及躯干强迫性抽搐，无法保持平衡。

(3)咀嚼行为：重复性的吐舌及下颚咀嚼行为。

0分：无；1分：偶然出现咀嚼运动；2分：频繁出现咀嚼运动；3分：持续性出现小幅度咀嚼运动；4分：强迫性大幅度重复咬噬动作并伴有频繁的吐舌行为。

(4)对侧旋转：向损毁对侧转身或旋转。

0分：无；1分：固定偏向一侧的转身，运动行为有可能增强；2分：间歇性稳定的对侧旋转；3分：持续性地对侧旋转，刺激可使之停止；4分：持续性的对侧旋转，刺激无法使之停止。

1.4.2 LID大鼠对侧旋转行为的评定 大鼠于复方地黄颗粒给药第4周、6周进行对侧旋转行为学观察，记录旋转起动时间(以s为单位，记录PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后开始向左侧旋转的时间)、旋转持续时间(以min为单位，记录PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴/苄丝肼后向左侧旋转的持续时间)、30min内旋转圈数(采用秒表记录，计算大鼠30min内向左侧旋转的圈数)、5min剂峰旋转圈数(采用秒表记录，计算大鼠5min内向左侧开始旋转的圈数)的动态变化。

1.4.3 APO诱导大鼠对侧旋转行为的评定 在LID模型制备成功后，复方地黄颗粒灌胃用药4、6周时腹腔注射APO 0.5mg/kg以诱发大鼠向损毁对侧旋转，记录开始旋转后30min内的总旋转圈数。

1.5 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料用表示，在满足方差齐性条件下，采用独立样本t检验进行两样本间的比较，采用单因素方差分析进行多样本比较，进一步两两比较采用LSD-t法。P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠AIM评分的动态变化 与正常组及假手术组比较，模型组大鼠AIM评分显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。复方地黄颗粒干预后，大鼠AIM评分显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01，表1)。

表1 大鼠AIM评分的动态变化(±s，n=10)Tab.1 Dynamic changes of AIM score of rats (±s,n=10)

表1 大鼠AIM评分的动态变化(±s，n=10)Tab.1 Dynamic changes of AIM score of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group,(2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with Model group

6 weeks after treatment NC 0 0 0 SO 0 0 0 Model 27.01±4.01(1)(2) 30.02±3.13(1)(2) 33.10±5.27(1)(2)CRG 28.45±3.45(1)(2) 21.63±2.99(1)(2)(3) 24.23±4.99(1)(2)(3)Group Before treatment 4 weeks after treatment

2.2 大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数的动态变化 与正常组及假手术组比较，模型组大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。复方地黄颗粒干预后，大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数较模型组显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01，表2)。

表2 大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数的动态变化(±s，n=10)Tab.2 Dynamic changes of rotation start time,rotation duration,rotation number,flux peak rotation number of rats (±s,n=10)

表2 大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数的动态变化(±s，n=10)Tab.2 Dynamic changes of rotation start time,rotation duration,rotation number,flux peak rotation number of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with M group

Item NC SO Model CRG Rotation start time(s)Before treatment 0 0 217.19±102.68(1)(2) 221.00±110.82(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 114.62±47.96(1)(2) 301.75±108.92(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 191.38±102.15(1)(2) 351.62±59.13(1)(2)(3)Rotation duration time (min)Before treatment 0 0 202.62±16.88(1)(2) 199.06±15.29(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 228.38±34.31(1)(2) 188.75±27.38(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 248.12±32.50(1)(2) 164.50±19.90(1)(2)(3)Rotation number Before treatment 0 0 669.38±211.19(1)(2) 670.56±220.45(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 931.00±254.79(1)(2) 450.12±140.07(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 733.62±241.96(1)(2) 423.38±139.12(1)(2)(3)Flux peak rotation number Before treatment 0 0 119.12±39.57(1)(2) 120.81±50.97(1)(2)4 weeks after treatment 0 0 171.12±60.11(1)(2) 88.75±39.33(1)(2)(3)6 weeks after treatment 0 0 156.75±50.71(1)(2) 59.75±29.88(1)(2)(3)

2.3 APO诱导后大鼠旋转圈数的动态变化 与正常组及假手术组比较，模型组大鼠旋转圈数显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。复方地黄颗粒干预后，大鼠旋转圈数明显缩短，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.01，表3)。

表3 APO诱导后大鼠旋转圈数的动态变化(±s，n=10)Tab.3 Dynamic changes of APO-induced rotation number of rats (±s,n=10)

表3 APO诱导后大鼠旋转圈数的动态变化(±s，n=10)Tab.3 Dynamic changes of APO-induced rotation number of rats (±s,n=10)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CRG.Compound Rehmannia granule.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with SO group; (3)P＜0.01 compared with M group

Group Before treatment 4 weeks after treatment 6 weeks after treatment NC 0 0 0 SO 0 0 0 Model 501.12±16.38(1)(2) 838.36±35.31(1)(2) 647.12±32.53(1)(2)CRG 499.06±15.39(1)(2) 485.75±27.48(1)(2)(3) 466.50±19.95(1)(2)(3)

3 讨 论

LID表现为舞蹈症或手足徐动样不自主运动，可累及头面部、四肢和躯干，有时表现为单调刻板的不自主动作或肌张力障碍，严重影响患者行动[10]。LID的发生机制尚不清楚，目前尚无根治办法。李晋梅等[11]筛选符合英国脑库PD诊断标准并且应用左旋多巴制剂至少1个月的患者，根据LID临床定义判断有无LID，分为异动和非异动两组，比较两组患者的性别、年龄、发病年龄、病程、体重、帕金森病综合评分量表(unified Parkinson's disease rating scale，UPDRS)等临床参数，以及左旋多巴最大日剂量、累计用药时间、单位体重用量等治疗参数方面上有无差异，并用logistic多因素回归分析LID的独立危险因素，结果发现PD患者发生LID的危险因素有多种，其中左旋多巴最大日剂量和单位体重的左旋多巴用量为独立危险因素。刘宇翔等[12]探讨帕金森病LID发生的相关因素，发现女性患者年龄及发病年龄较轻、病程较长、使用左旋多巴日剂量较大者易发生LID。张旺明等[13]认为，左旋多巴诱导的LID是PD患者常见的、致残性的服药晚期并发症，一旦症状出现，则无法通过药物治疗得到显著缓解。

近年来大量的研究表明，中医药无论是在PD治疗方面，还是在降低左旋多巴的不良反应方面都卓有成效。中医学认为，LID属于“颤证”范畴，又称“震振”、“振掉”、“震颤”，基本病机为肝风内动，筋脉失养。复方地黄颗粒由熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母、丹参、石菖蒲、全蝎组成；方中熟地黄性温味甘，归肝肾经，善补益肾精、滋阴养血、固本培元，故为君药；钩藤甘凉，入肝心经，功效熄风定惊、化痰舒筋；珍珠母性味咸寒，归肝心经，可滋阴潜阳、定惊止颤、养血舒筋，柔肝与熄风两者兼顾，滋阴与养血并疗，乃平肝潜阳之要药；白芍性味苦酸微寒，归肝脾经，养肝血、滋肝阴、柔肝气，为养血濡筋、缓急止颤之良药，与钩藤、珍珠母同用，可助君药滋阴养血、熄风平肝，共为臣药；丹参味苦，微寒，归心、心包、肝经，功效养血、活血、化瘀；石菖蒲辛苦温，归心胃经，功效化痰除湿、开窍醒神，共为佐药；全蝎辛平有毒，归肝经，集解毒熄风、化痰祛瘀、通络散结于一体，为使药。上述诸药合用，可滋补肝肾、活血化痰、散结解毒[2]。

本研究采用二点法将6-OHDA注射于SD大鼠右侧黑质来构建PD动物模型，向PD大鼠腹腔注射左旋多巴/苄丝肼，成功构建阴虚动风证帕金森病LID模型。本课题组前期研究证实，该模型具有疾病(帕金森病LID)和证候(阴虚动风证)的双重特征[6]。PD模型大鼠出现了神经行为学的异常变化，如大鼠AIM评分出现异常变化，大鼠旋转起动时间、持续时间、旋转圈数、剂峰旋转圈数存在动态变化，APO诱导后大鼠出现旋转圈数的动态变化。这些表现和PD患者的临床证候高度类似，如震颤、肌强直、运动迟缓、自主神经功能障碍等，为研究复方地黄颗粒干预PD提供了动物模型支撑。本研究结果显示，复方地黄颗粒干预后，LID大鼠AIM评分显著降低，旋转起动时间延长，旋转持续时间缩短，旋转圈数及剂峰旋转圈数减少，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，表明复方地黄颗粒可改善帕金森病LID模型大鼠的神经行为学表现，缓解LID乃至PD症状。