血清氨基酸和CEA/CA19-9联合测定对结直肠癌诊断的价值

路丽娟，刘明浩，胡文炜，马萍，王瑞玲

结直肠癌(colorectal cancer)是我国常见的消化道恶性肿瘤。近年来，随着生活方式的变化和人口老龄化的加剧，结直肠癌的发病率逐年升高。但现有的结直肠癌筛查方法的特异性和敏感性都比较低，且结直肠癌诊断的金标准——结直肠镜加病理活检为有创检查，大多数无症状的潜在人群难以接受[1]。此外，如果受检人群肠道准备欠佳或医生缺乏相应的操作经验，结直肠镜检查也易出现漏诊，据报道其漏诊率可达5%[2]。因此，结直肠癌的早期非侵入性诊断是一项具有挑战性的工作。

代谢组学(metabolomics，MS)是近年发展起来的新技术，可以揭示脂质、糖类、核苷酸、氨基酸等小分子物质的代谢过程，有助于发现预测和治疗肿瘤的新物质。氨基酸是构成人体的基本物质，广泛地参与蛋白质、脂肪、糖类等的代谢过程，其在疾病的早期可能就已发生了显著变化[3-4]。液相色谱-串联质谱技术(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)是常用的氨基酸代谢检测方法，它集中了高效液相色谱的高分离性能与质谱的高灵敏度、高专属性[5]。本研究利用LC-MS/MS对结直肠腺瘤和结直肠癌患者的血液样本进行分析，以期发现可以早期预警结直肠癌的标志物，从而为高危结直肠息肉患者制定合理的随访周期。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2017年8－12月于火箭军总医院消化内科和肛肠外科确诊的结直肠癌患者30例，男16例，女14例，年龄(60.6±11.8)岁；选择同期结直肠腺瘤30例作为对照，男22例，女8例，年龄(60.1±12.2)岁。两组年龄、性别等差异无统计学意义(P＞0.05)。所有病例均行结直肠镜检查或手术切除治疗，并经组织病理学检查确诊。纳入标准[6]：①有腹痛、便潜血阳性、便秘等下消化道症状，影像学提示结直肠壁增厚，肿瘤标志物异常；②须行结直肠镜或手术治疗，但还未进行手术治疗者；③结直肠组织病理学确诊为结直肠腺癌、结直肠腺瘤。排除标准[7]：①有其他部位肿瘤；②经过放疗、化疗或手术治疗的患者；③曾经切除过肠道息肉；④有代谢系统疾病；⑤有其他肠道疾病；⑥近期遭受过重大应激反应；⑦经病理证实排除结直肠癌或结直肠腺瘤。本课题经火箭军总医院医学伦理委员会审批，纳入研究的结直肠癌和结直肠腺瘤患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 氨基酸混合标准液(MSLAB50AA-01)、衍生剂(MSLAB50AA-02)、蛋白沉淀剂(MSLAB50AA-03)、标记缓冲液(MSLAB50AA-04)、流动相调节剂A(MSLAB50AA-05)、流动相调节剂B(MSLAB50AA-06)、质谱用氨基酸检测试剂盒(MSLAB50AA)购自北京生物质谱有限公司。甲醇(A452-4)、乙腈(A998-4)购自美国Fisher公司，冷冻高速离心机(1424R/1524R)购自珠海黑马医学仪器有限公司)，戴安液相色谱仪(UltiMate3000)购自美国戴安公司)，MS质谱(API 3200 Q TRAP)购自美国AB公司，罗氏602购自瑞士罗氏公司。

1.3 方法

1.3.1 样本收集 受试者禁食12h，于上午空腹抽取肘静脉血样2管，每管3～5ml，置于肝素锂抗凝管。一管混匀后30min内离心分离血清并置于–80℃冰冻保存，用于测定氨基酸；另一管于2h内送至检验科测定血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和糖类抗原CA19-9。

1.3.2 氨基酸测定 根据文献[5]的方法，共测定50种氨基酸及其衍生物的水平。测定步骤如下：取氨基酸混合标准液、待测样本各50μl，加入50μl蛋白沉淀剂，混匀后13 200r/min冷冻离心4min；取上清10μl，加50μl标记缓冲液混匀，瞬时离心，再次加入20μl衍生液混匀，瞬时离心，置于55℃恒温衍生15min；样本置冰箱冷却，混匀，瞬时离心，取50μl上机检测。每个样品重复3次。

色谱条件：色谱柱MSLab45AA-C18(150.0mm×4.6mm，5μm)，柱温50℃，流速1ml/min，流动相[A水相：水(1‰甲酸)；B有机相：乙腈(1‰甲酸)]0～37℃梯度洗脱，进样量5μl。

质谱条件如下。离子源：+ESI电喷雾离子源；扫描方式：MRM多反应监测；CUR：20psi(气帘气)；IS：+5500V(喷雾电压)；CAD：Medium(碰撞气)；CXP：2.0(碰撞室射出电压)；GS1：55psi(雾化气)；TEM：500℃(雾化温度)；EP：10(射入电压)；GS2：60psi(辅助气)。

1.3.3 CEA/CA19-9测定 CEA和CA19-9由我院检验科技术人员采用电化学发光法测定。CA19-9正常值范围0～37U/ml，CEA正常值范围0～6.5ng/ml。

1.4 统计学处理 采用Excel建立数据库，SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验；采用二分类logistic回归比较联合检测的诊断效能；采用Hanley和McNeil等[8]的方法比较受试者工作曲线(ROC)下面积。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清氨基酸和CEA、CA19-9测定结果 测定的50种氨基酸中，有5种氨基酸在结直肠癌和结直肠腺瘤中的差异有统计学意义(P＜0.05)。两组CEA和CA19-9差异均有统计学意义(P＜0.05，表1)。29例结直肠腺瘤患者CEA/CA19-9正常，其中有1例患者同时存在CEA/CA19-9异常。结直肠腺癌中有20例CEA正常，26例CA19-9正常，其中2例患者同时存在CEA/CA19-9异常。

表1 两组有差异的5种氨基酸及CEA/CA19-9检测结果(±s，n=30)Tab.1 Diversely existed amino acids and CEA/CA19-9 results between the two groups (±s,n=30)

表1 两组有差异的5种氨基酸及CEA/CA19-9检测结果(±s，n=30)Tab.1 Diversely existed amino acids and CEA/CA19-9 results between the two groups (±s,n=30)

EtN.Ethanolamine; Cit.Citrulline; 5-HT.5-hydroxy tryptamine;Val.Valine; Leu.Leucine; CEA.Carcinoembryonic antigen

t P EtN (μmol/L) 8.73±3.35 10.94±5.00 –2.011 0.049 Cit (μmol/L) 42.88±16.47 54.74±18.77 –2.602 0.012 5-HT (μmol/L) 0.17±0.13 0.10±0.14 2.151 0.036 Val (μmol/L) 285.63±54.42 256.17±49.29 2.198 0.032 Leu (μmol/L) 140.41±34.38 122.03±33.17 2.107 0.039 CEA (ng/ml) 2.51±2.09 15.39±32.65 2.155 0.040 CA19-9 (U/ml) 11.66±9.92 25.27±27.18 2.577 0.014 Item Colorectal adenoma group Colorectal adenocarcinoma group

2.2 CEA/CA19-9联合或不联合5种氨基酸对结直肠癌诊断的预测价值 ROC曲线结果(图1)显示，联合测定5种氨基酸和CEA/CA19-9对结直肠癌的诊断效果明显优于单独测定CEA/CA19-9，两者曲线下面积分别为0.908(95%CI：0.838～0.978)和0.791(95%CI：0.678～0.904)，差异有统计学意义(P=0.026)。联合测定血清氨基酸和CEA/CA19-9诊断结直肠癌的敏感性和特异性均明显优于单独测定CEA/CA19-9(表2)。

图1 CEA/CA19-9联合或不联合5种氨基酸对结直肠癌诊断价值的ROC曲线分析Fig.1 ROC curves of CEA/CA19-9 with or without 5 kinds of amino acids on the diagnosis of colorectal cancer

表2 CEA/CA19-9联合或不联合5种氨基酸对结直肠癌诊断的预测价值Tab.2 Predictive values of CEA/CA19-9 with or without 5 kinds of amino acids on the diagnosis of colorectal cancer

3 讨 论

结直肠癌预后与早期诊断密切相关，大多数早期结直肠癌是可治愈的，5年生存率达90%，而晚期则不足10%[9]。因此，结直肠癌的早期诊断非常重要。自20世纪80年代我国就已开始重视结直肠癌的筛查，据报道通过普通筛查，可以使受检人群结直肠癌的累积病死率下降14.7%[10]。指南推荐对于结直肠癌家族史不详者于40岁进行结直肠癌筛查，而无家族史者于50岁开始筛查，筛查终止于75岁[11]。对于筛查过程中发现结直肠息肉者，应该结合我国国情以及患者血液肿瘤标志物的动态变化制定合理的随访周期。结直肠腺瘤是结直肠癌的癌前病变，我国目前还没有结直肠息肉切除术后结肠镜随访周期的指南。无规律的随访时间不仅会造成患者的经济负担、加重医疗压力，同时也会导致部分癌变高危人群漏诊。目前，随着结直肠癌发病机制研究的深入，尽早发现有价值的诊断性标志物对于早期发现和诊治结直肠癌、减轻社会医疗负担意义重大。

肿瘤患者代谢紊乱十分常见，但其机制研究甚少，肿瘤细胞能量代谢重编程是最新提出的肿瘤细胞特征[12]。有研究显示，氨基酸代谢也参与了肿瘤细胞代谢过程，基于LC-MS/MS的氨基酸代谢组学可以发现其代谢物质的变化，以进一步提高结直肠肿瘤的早期发现率[5]。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是人体最丰富的非必需氨基酸，也是细胞培养基中不可或缺的成分，其广泛参与三羧酸循环，为肿瘤细胞的生长发育提供氮源并参与细胞的信号传导[13]。本研究虽然未在结直肠腺瘤和结直肠腺癌之间发现Gln浓度上的差异，但结直肠癌患者中Gln的浓度高于结直肠腺瘤[(524.93±118.74)vs.(546.10±70.12)]，说明癌症患者存在对Gln的高需求。Li等[14]发现大多数结直肠癌细胞系可过度表达磷酸丝氨酸磷酸酶(PSPH)，而后者可以调节丝氨酸(serine，Ser)和甘氨酸(glycine，Gly)的合成，并支持结直肠癌细胞的生长。该研究还发现从饮食中剔除Ser和Gly，小鼠结直肠癌的发展速度明显减慢。本研究发现，与结直肠腺瘤比较，结直肠癌中Ser和Gly的表达升高。但本研究中Gln、Ser、Gly在结直肠腺瘤和结直肠癌中的表达差异无统计学意义，可能与纳入的样本数量有关系。Deng等[15]对美国印第安纳州的结直肠腺瘤和结直肠腺癌进行研究，发现酪氨酸(tyrosine，Tyr)、组氨酸(histidine，His)、Gly、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、Val等23种代谢产物的表达在两组间有差异。本研究也发现结直肠腺瘤和结直肠腺癌中Val水平存在明显差异，提示Val将来很有可能应用到临床肿瘤标志物中。两项研究存在差异的原因可能是Deng等[15]纳入的是欧美人群，与本研究纳入的本国人群存在饮食、生活习惯、体型等方面的不同有关。

CEA是从结直肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，通常由中空的器官分泌，研究显示其诊断结直肠癌的敏感性和特异性分别是36%和87%[16]。糖类抗原CA19-9是一种黏蛋白型的糖蛋白肿瘤标志物，在结直肠癌、食管癌、肝癌中均可能升高，其诊断结直肠癌的敏感性和特异性分别为23%和96%[17]。本研究中将CEA与CA19-9联合诊断结直肠癌，发现其ROC曲线下面积为0.791，而Etn、Cit、5HT、Val、Leu与CEA/CA19-9联合诊断结直肠癌的ROC曲线下面积是0.908，两者差异有统计学意义(P=0.026)。有文献报道消化道肿瘤标志物联合检测可以提高结直肠癌的发现率，但临床上可预测结直肠癌的标志物尚不足[18]。在临床工作中，内镜医师对于患有结直肠腺瘤性息肉的患者常会告知密切观察，并根据结直肠息肉的数量、大小、病理类型等告知患者需要结直肠镜随访的周期。目前随访周期均参考欧美指南，对于息肉病理类型为高级别不典型增生、有绒毛成分，腺瘤直径≥10mm或息肉数目＞3个，即判断为高危人群，推荐3年后复查，其他低危险性息肉可以5～10年后复查[19-20]。Ewing等[21]报道结直肠癌的发生与多组基因突变密切相关，而基因突变必然会影响基因表达产物的变化，如果能测定这些表达产物，就可以发现易患癌症的高危人群。目前，我国尚没有结直肠息肉切除术后随访周期相关的共识意见及指南。本研究发现结直肠腺瘤与结直肠腺癌在氨基酸代谢产物及CEA、CA19-9的表达上存在差异，将来或许可以作为结直肠息肉切除后患者随访周期的一个参考指标。对于上述标志物表达正常的患者，可以适当延长随访时间，而标志物表达异常的患者，提示癌变概率增加，应该缩短随访时间，以减少过多的检查给患者带来的风险和经济压力，并避免有恶变倾向的高危患者漏诊。