复方地黄颗粒对阴虚动风证帕金森病模型大鼠神经营养因子及其受体的影响

梁建庆，何建成

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，目前尚无理想的防治措施，传统治疗以左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-lalanine，L-DOPA)为主，但常出现诸多不良反应如“开关”现象、异动症等，且随着服用药物时间的延长，不良反应明显加重。本课题组前期研究表明，无论是在PD治疗，还是降低L-DOPA的不良反应方面，复方地黄颗粒均有较好疗效[1]。基于此，本研究制备阴虚动风证PD大鼠模型，采用复方地黄颗粒进行干预治疗，检测大鼠脑内神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)及其受体表达，以探索复方地黄颗粒治疗PD的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及条件 雄性SPF级SD大鼠，体重180～200g，由上海中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SYXK(沪)2008-0016)。动物饲养环境：恒温(23±2)℃，相对湿度60%～65%，自动光-暗控制(7:00～19:00光照，19:00～7:00暗置)，动物摄食、饮水及活动自由。

1.2 主要试剂和仪器 6-羟基多巴胺(6-OHDA，批号：MKBP0832V)、阿扑吗啡(apomorphine，APO，批号：SLBF6369V)、抗坏血酸(批号063K1082)为美国Sigma公司产品；美多芭(Madopar，0.25g/片，批号：SH1737)购自上海罗氏制药有限公司；庆大霉素(0.3g/支)购自上海第一制药厂。抗神经生长因子(nerve growth factor，NGF)抗体、抗脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)抗体、抗胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)抗体、抗原肌球蛋白受体激酶A(tropomyosin receptor kinase A，TrkA)抗体、抗TrkB抗体、抗Ret抗体、抗酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗体、抗β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自英国Abcam公司；抗GDNF家族受体α1(GDNF family receptor α1，GFRα1)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。大鼠脑立体定位仪(RWD-68003型)购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；化学发光成像系统(FC-M型)购自美国ProteinSimple公司。

1.3 药物制备 复方地黄颗粒委托国家中药制药工程技术研究中心制备。处方：熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母、丹参、石菖蒲、全蝎，上海中医药大学提供。制法：以上七味，加水浸泡、煎煮、滤过，滤液减压浓缩成相对密度1.30(60℃)的清膏，减压干燥，粉碎。辅料采用淀粉与糊精的等比混合物，浸膏粉与辅料比为2:1。大鼠的每日用药量按孙瑞元教授[2]创制的标准体重大鼠每日用量方法计算。

1.4 模型制备、分组及给药 阴虚动风证PD大鼠模型采用Ungerstedt等[3]建立并经过本课题组验证的二点法进行构建[4-6]。采用分层随机法将50只阴虚动风证PD模型大鼠随机分为5组：模型组(Model组)，美多芭组(Madopar组，150mg/kg)，复方地黄颗粒低剂量组(CLD组，3.5g/kg)、复方地黄颗粒中剂量组(CMD组，7g/kg)、复方地黄颗粒高剂量组(CHD组，14g/kg)，每组10只；另取大鼠10只不作造模处理设为正常对照组(NC组)，10只只注射0.2%抗坏血酸设为假手术组(SO组)。复方地黄颗粒和美多芭分别用蒸馏水溶解，每天灌胃1次；正常对照组、假手术组和模型组以等体积蒸馏水(2ml/只)灌胃，连续用药6周。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.5 实验指标测定

1.5.1 RT-qPCR检测大鼠损毁侧纹状体神经营养因子及其受体mRNA以及黑质及纹状体TH mRNA水平

每组各取6只大鼠，采用3%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速开颅取出脑组织，在冰上小心分离损毁侧黑质和纹状体，称重后冻存备用。提取总RNA，合成cDNA模板，引物序列见表1。扩增条件：95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min，共循环40次。采用2–ΔΔCt法计算mRNA相对水平[7]。

1.5.2 Western blotting法检测大鼠损毁侧纹状体NGF、BDNF、GDNF蛋白以及黑质及纹状体TH蛋白表达 常规蛋白质抽提，行Western blotting分析。采用AlphaView图像分析软件对目标条带进行灰度分析，以β-actin为参照计算相对表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示。在满足方差齐性条件下，多组间比较采用单因素方差分析进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-qPCR测定用神经营养因子及其受体引物序列Tab.1 Primer sequences of neurotrophic factors and their receptors for RT-qPCR

2 结 果

2.1 复方地黄颗粒对大鼠损毁侧纹状体相关因子mRNA以及黑质及纹状体TH mRNA水平的影响与正常对照组比较，模型组大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH的mRNA水平明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，美多芭组及复方地黄颗粒各剂量组大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH mRNA水平均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；美多芭组及复方地黄颗粒中剂量组上述因子mRNA水平明显高于复方地黄颗粒低剂量及高剂量组(P＜0.01)；复方地黄颗粒中剂量组mRNA水平与美多芭组比较，差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

表2 复方地黄颗粒对PD模型大鼠损毁侧纹状体相关因子及黑质、纹状体TH的mRNA水平的影响(±s，n=6)Tab.2 Effect of compound Rehmannia granule on the mRNA levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (±s,n=6)

表2 复方地黄颗粒对PD模型大鼠损毁侧纹状体相关因子及黑质、纹状体TH的mRNA水平的影响(±s，n=6)Tab.2 Effect of compound Rehmannia granule on the mRNA levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (±s,n=6)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CLD.Compound low dose; CMD.Compound medium dose; CHD.Compound high dose; NGF.Nerve growth factor; BDNF.Brain derived neurotrophic factor; GDNF.Glial cell line-derived neurotrophic factor.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with model group; (3)P＜0.01 compared with CLD and CHD group; (4)P＜0.01 compared with Madopar group

Group NC SO Model Madopar CLD CMD CHD NGF 0.9902±0.01910.9926±0.02000.1548±0.0123(1)0.8018±0.0131(2)(3)0.5293±0.0191(2)0.7965±0.0153(2)(3)(4)0.3267±0.0147(2)BDNF 0.9940±0.02500.9917±0.02440.2570±0.0161(1)0.7537±0.0271(2)(3)0.5551±0.0196(2)0.7536±0.0293(2)(3)(4)0.4452±0.0195(2)GDNF 0.9995±0.02400.9917±0.02450.2013±0.0295(1)0.7047±0.0306(2)(3)0.4583±0.0202(2)0.7032±0.0302(2)(3)(4)0.3544±0.0203(2)TrkA 1.0000±0.02551.0004±0.02500.2251±0.0159(1)0.7813±0.0189(2)(3)0.4807±0.0191(2)0.7812±0.0217(2)(3)(4)0.3135±0.0145(2)TrkB 0.9924±0.01370.9834±0.03350.1839±0.0277(1)0.7740±0.0423(2)(3)0.5844±0.0286(2)0.7766±0.0416(2)(3)(4)0.3953±0.0177(2)GFR-α10.9825±0.0276 0.9942±0.02690.1658±0.0168(1)0.8256±0.0301(2)(3)0.4837±0.0211(2)0.8040±0.0153(2)(3)(4)0.2950±0.0287(2)Ret 0.9827±0.0256 0.9957±0.02830.2451±0.0291(1)0.7529±0.0204(2)(3)0.6026±0.0282(2)0.7740±0.0265(2)(3)(4)0.3785±0.0346(2)TH 0.9985±0.02640.9988±0.01450.1753±0.0135(1)0.7942±0.0291(2)(3)0.5040±0.0273(2)0.8035±0.0284(2)(3)(4)0.3145±0.0144(2)

2.2 复方地黄颗粒对大鼠损毁侧纹状体NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret蛋白，以及黑质及纹状体TH蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH的蛋白表达明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，美多芭组及复方地黄颗粒各剂量组大鼠NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH 蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；美多芭组及复方地黄颗粒中剂量组蛋白表达水平明显高于复方地黄颗粒低剂量及高剂量组(P＜0.01)；复方地黄颗粒中剂量组的蛋白表达水平与美多芭组差异无统计学意义(P＞0.05，表3，图1)。

表3 复方地黄颗粒对PD模型大鼠损毁侧纹状体相关因子及黑质、纹状体TH的蛋白表达的影响(/β-actin，±s，n=6)Tab.3 Effect of compound Rehmannia granule on expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (/β-actin,±s,n=6)

表3 复方地黄颗粒对PD模型大鼠损毁侧纹状体相关因子及黑质、纹状体TH的蛋白表达的影响(/β-actin，±s，n=6)Tab.3 Effect of compound Rehmannia granule on expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats (/β-actin,±s,n=6)

NC.Normal control; SO.Sham operation; CLD.Compound low dose; CMD.Compound medium dose; CHD.Compound high dose; NGF.Nerve growth factor; BDNF.Brain derived neurotrophic factor; GDNF.Glial cell line-derived neurotrophic factor.(1)P＜0.01 compared with NC group; (2)P＜0.01 compared with model group; (3)P＜0.01 compared with CLD and CHD group; (4)P＜0.01 compared with Madopar group

Group NC SO Model Madopar CLD CMD CHD NGF 1.364±0.008 1.366±0.012 0.327±0.016(1) 0.887±0.022(2)(3) 0.634±0.020(2) 0.882±0.017(2)(3)(4) 0.521±0.011(2)BDNF 1.889±0.011 1.896±0.008 0.264±0.014(1) 0.988±0.012(2)(3) 0.820±0.016(2) 1.002±0.019(2)(3)(4) 0.526±0.012(2)GDNF 0.912±0.028 0.902±0.029 0.077±0.010(1) 0.710±0.012(2)(3) 0.300±0.019(2) 0.709±0.014(2)(3)(4) 0.215±0.014(2)TrkA 1.603±0.029 1.603±0.018 0.067±0.011(1) 0.874±0.032(2)(3) 0.502±0.009(2) 0.878±0.022(2)(3)(4) 0.136±0.021(2)TrkB 3.013±0.013 3.010±0.019 0.298±0.016(1) 1.204±0.021(2)(3) 0.904±0.017(2) 1.197±0.022(2)(3)(4) 0.596±0.008(2)GFR-α1 2.513±0.013 2.520±0.010 0.153±0.011(1) 0.902±0.009(2)(3) 0.743±0.010(2) 0.892±0.009(2)(3)(4) 0.301±0.009(2)Ret 1.202±0.011 1.194±0.014 0.165±0.009(1) 0.914±0.011(2)(3) 0.602±0.020(2) 0.918±0.013(2)(3)(4) 0.315±0.013(2)TH 1.058±0.035 1.053±0.021 0.145±0.011(1) 0.813±0.019(2)(3) 0.581±0.019(2) 0.816±0.024(2)(3)(4) 0.410±0.012(2)

图1 复方地黄颗粒对PD模型大鼠损毁侧纹状体相关因子及黑质、纹状体TH的蛋白表达的影响Fig.1 Effect of compound Rehmannia granule on the expression levels of related factors of lesioned striatum and TH of substantia nigra in PD model rats

3 讨 论

PD病在筋脉，与肝、脾、肾等脏关系密切。基本病机为肝风内动，筋脉失养。本课题组提出“滋肾平肝、化痰活血、解毒散结”诸法合用是其治疗法则[8]。据此立法组方，结合古、现代医家治疗PD应用较多的中药和方剂，并继承名老中医经验，研制出治疗PD的中药复方——复方地黄颗粒[9]。方由熟地黄、白芍、钩藤、珍珠母、丹参、石菖蒲、全蝎组成。方中熟地性温味甘，归肝肾经，善补益肾精、滋阴养血、固本培元，故为君药；钩藤甘凉，入肝心经，功效熄风定惊、化痰舒筋；珍珠母性味咸寒，归肝心经，可滋阴潜阳、定惊止颤、养血舒筋，柔肝与熄风两者兼顾，滋阴与养血并疗，乃平肝潜阳之要药；白芍性味苦酸微寒，归肝脾经，养肝血、滋肝阴、柔肝气，为养血濡筋、缓急止颤之良药，与钩藤、珍珠母同用，可助君药滋阴养血、熄风平肝，共为臣药；丹参味苦，微寒，归心、心包、肝经，功效养血、活血、化瘀；石菖蒲辛苦温，归心胃经，功效化痰除湿、开窍醒神，共为佐药；全蝎辛平有毒，归肝经，集解毒熄风、化痰祛瘀、通络散结于一体，为使药。上述诸药合用，可滋补肝肾、活血化痰、散结解毒。

在PD动物模型研发中，大鼠对6-OHDA相对敏感[10]，6-OHDA致PD大鼠模型是目前应用最多的动物模型之一，可引起大鼠黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性死亡，乃至缺失，DA含量降低；黑质-纹状体系统TH活性减弱。造模成功后，大鼠出现不同程度的运动功能障碍和震颤[11]，与PD患者临床症状有高度相似之处。本研究选择SD大鼠成功制备了阴虚动风证PD模型[4,12]，为后续研究奠定了基础。

NTFs是一组促进神经生长发育、导向和功能维持所必须的因子，最有代表性的是NGF、BDNF和GDNF三大类，其中NGF具有营养神经元和促进突起生长的功能，BDNF有助于黑质DA能神经元分化和存活，GDNF对DA能神经元有特异性的营养作用[13]。NGF的受体是TrkA，BDNF的受体是TrkB，GDNF的受体是GFR-α1，Ret蛋白是GDNF信号转导受体。TH可在DA能神经元胞质内催化酪氨酸形成L-DOPA，L-DOPA经芳香簇氨基酸脱羧酶催化形成DA。TH是DA生物合成的限速酶，该酶在黑质-纹状体系统中质(活性)和量(表达)的变化会直接影响到L-DOPA的合成，与PD的发病密切相关[14]。

在本研究中，与模型组比较，美多芭组及复方地黄颗粒各剂量组大鼠的NGF、BDNF、GDNF、TrkA、TrkB、GFR-α1、Ret、TH mRNA及蛋白的表达升高(P＜0.01)，提示复方地黄颗粒对PD的治疗作用是通过改善NTFs及其受体的途径实现的；与复方地黄颗粒低剂量及高剂量组比较，美多芭组及复方地黄颗粒中剂量组的上述NTFs及其受体、TH的mRNA及蛋白表达明显升高(P＜0.01)，提示中剂量复方地黄颗粒的疗效最佳；与美多芭组相比较，复方地黄颗粒中剂量组NTFs及受体、TH的mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)，表明中剂量复方地黄颗粒与西药美多芭的疗效相当。

综上所述，复方地黄颗粒对6-OHDA诱导的阴虚动风证PD模型大鼠有较明显的DA能神经元保护作用。在复方地黄颗粒各剂量组中，以中剂量组的疗效最好，可为今后该复方的毒理学试验提供剂量参考。