西咪替丁对低剂量60Coγ射线照射小鼠肠道免疫组织的保护作用

何颖，张俊玲，沈先荣，赵忆宁，刘玉明，刘琼，李珂娴，陈伟，罗群，原维鸿

肠道是电离辐射最敏感的靶器官之一，肠黏膜屏障则是肠道放射损伤的首要靶点。全身或腹部局部照射后会出现小肠损伤，严重时可导致急性放射性肠炎，甚至肠型放射病而死亡[1-3]。随着我国核能和平利用的增多及放射治疗的普及，肠道辐射损伤患者也越来越多，但迄今有关肠道辐射损伤的治疗尚无理想的方法。一直以来对急性放射损伤研究较多，对平战时低剂量和低剂量率电离辐射导致的环境和健康危害[4-6]认识不够，相关研究进展缓慢。

西咪替丁(cimetidine，CMD)临床上主要用于治疗十二指肠溃疡、上消化道出血等。随着药理学研究的不断深入，西咪替丁作为免疫调节药物已成功用于修复恶性肿瘤、低丙种球蛋白血症、多形红斑、银屑病以及艾滋病相关综合征等的免疫功能[7-10]。研究还发现，西咪替丁具有许多不同于其他H2受体拮抗剂的新用途，尤其是其辐射防护作用[11-14]，该作用的发挥与受照动物免疫功能调节有关。相关证据包括，照射前给予西咪替丁可抑制T抑制性细胞及促进CD4+淋巴细胞增殖[15-16]。笔者前期研究也发现，西咪替丁能促使低剂量率中子和γ射线混合照射大鼠的淋巴细胞增殖，且其胸腺指数和脾指数明显升高[17]。

作为机体接触外来抗原最多的器官，肠道含有丰富的对射线高度敏感的淋巴细胞。本研究着眼于肠道免疫系统，采用1.0Gy60Co γ射线照射小鼠，探讨西咪替丁对较低剂量照射小鼠肠道免疫功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 流式细胞仪(BD Accuri C6，BD公司，美国)。西咪替丁(山西同达药业有限公司，批号：140401)；阳性药物523(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，批号：20080801)；细胞凋亡原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测试剂盒(Roche公司，瑞士)；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素+碘化丙啶(annexin-V-fluorescein isothiocyanate+propidium iodide，Annexin-V-FITC+PI)凋亡检测试剂盒(BD公司，美国)；FITC标记抗小鼠分化抗原(cluster of differentiation，CD)3抗体(BioLegend公司，美国)；藻红蛋白-菁色素(phycoerythrin-cyanine5，PE-Cy5)标记抗小鼠 CD19抗体(eBioscience公司，美国)。

1.2 实验动物与分组 雄性C57小鼠，6～8周龄，体重(20±2)g，动物合格证号：SCXK(沪)2013-0016。60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照(NC)组，照射模型(RM)组，阳性对照(PC)组，西咪替丁低剂量(CMDL)组(33.3mg/kg)，西咪替丁中剂量(CMDM)组(100mg/kg)，西咪替丁高剂量(CMDH)组(300mg/kg)。实验方案通过第二军医大学海军医学研究所动物伦理委员会批准，动物处置过程中所有操作均符合动物伦理学标准。

1.3 照射及给药方案 照射地点为海军医学研究所辐照中心，除正常对照组外，其他各组以60Co γ射线全身照射，照射剂量为1.0Gy，剂量率为8.33mGy/min。西咪替丁各剂量组照射前经口连续给药6d，每天1次，照射后5h再给药1次；阳性药物523于照射前1d经口给药1次，20mg/kg，照射后5h给药1次，10mg/kg。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠肠免疫组织病理形态学观察 照射后24h取小鼠小肠，10%甲醛溶液固定2～3d后，石蜡包埋制片，行苏木素-伊红(HE)染色和过碘酸-雪夫(periodic acid- Schiff，PAS)染色，光镜下观察肠免疫组织损伤、修复情况及杯状细胞数量变化并采集图像。

1.4.2 TUNEL法检测小肠黏膜免疫细胞凋亡 采用细胞凋亡检测试剂盒，参照试剂盒说明书进行检测。石蜡切片经脱蜡、抗原修复、封闭、标记、显色、复染等处理，光镜下观察小肠组织TUNEL染色情况。

1.4.3 全肠派伊尔结(Peyer's patch，PP)淋巴细胞悬液制备 照射后24h活杀小鼠，沿肠壁剪下PP，于0.01mmol/L PBS(含1%胎牛血清)体系中100目网筛研磨、过滤；滤液3000r/min离心5～10s，并重悬于NH4Cl溶液，待用。

1.4.4 流式细胞术检测肠PP淋巴细胞凋亡率 用0.01mmol/L PBS调整细胞密度为1×106个/ml，取lml细胞重悬于200μl结合缓冲液，加入10μl Annexin-V及5μl PI，室温避光反应15min，加入300μl结合缓冲液。流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。

1.4.5 流式细胞术检测T、B细胞数的变化 调整细胞密度至1×107个/ml。加入2μl FITC标记抗CD3抗体及4μl PE-Cy5标记抗CD19抗体，混匀；室温避光反应30min，0.01mmol/L PBS洗涤并重悬细胞于500μl体系；流式细胞仪检测T、B淋巴细胞群数量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对小鼠肠免疫组织病理损伤的影响 正常对照组小鼠小肠各部分结构染色清晰，绒毛完整，柱状上皮细胞排列整齐，黏膜内固有层及淋巴管中淋巴免疫细胞形态结构正常，未见水肿现象(图1A)。1.0Gy照射后24h，小肠绒毛整体胞质着色变淡，有轻微损伤(图1B)。阳性药对照组肠绒毛上皮细胞排列相对整齐(图1C)；西咪替丁各剂量组肠腺结构完整，绒毛上皮细胞排列致密，上皮细胞之间紧密连接，肠组织总体结构接近正常(图1D－F)。

图1 小鼠肠免疫组织病理学变化(HE ×200)Fig.1 Pathological changes of intestinal immune tissues in mice (HE staining ×200)

2.2 对小鼠小肠杯状细胞的影响 杯状细胞呈高脚酒杯状，细胞上端膨大，下端细小，杯内积有大量的黏液颗粒。HE染色由于标本处理的原因镜下黏液颗粒丢失而呈空泡状。PAS染色即糖原染色后红染部分为杯状细胞。如图2A所示，正常对照组杯状细胞分布广泛。1.0Gy60Co γ射线照射后24h，肠腺(隐窝)处杯状细胞染色较淡(图2B)，表明杯状细胞有轻微损伤。阳性药对照组除了肠腺处染色较淡，其他各处均接近正常对照组(图2C)。西咪替丁各剂量组与正常对照组比较未见明显变化，提示杯状细胞较为正常(图2D－F)。

图2 小鼠小肠杯状细胞的变化(PAS ×200)Fig.2 Changes of goblet cells in small intestine of mice (PAS staining ×200)

2.3 对小鼠肠道淋巴细胞凋亡的影响 TUNEL检测结果显示，正常对照组小鼠肠免疫组织中偶见凋亡细胞，核呈棕黄色改变(图3A)。照射后24h，肠黏膜免疫组织中凋亡的淋巴细胞明显增加(图3B)，尤其在固有层隐窝处更为明显。阳性药对照组黏膜固有层及黏膜绒毛内可见凋亡的淋巴细胞(图3C)。西咪替丁各剂量组仅在隐窝处见少量凋亡的淋巴细胞，与照射模型组比较，凋亡的细胞明显减少，接近正常对照组(图3D－F)。

流式细胞术检测结果进一步显示，1.0Gy60Co γ射线照射后24h，模型对照组小鼠肠道PP淋巴细胞凋亡率较正常对照组明显增加(P＜0.01)，约是后者的2倍(表1)。与模型对照组比较，各给药组PP淋巴细胞凋亡率均明显下降，差异有统计学意义；其中西咪替丁中剂量组抑制辐射所致PP淋巴细胞凋亡的作用最强，优于阳性药对照组(P＜0.01)。

表1 西咪替丁对低剂量照射小鼠肠道PP淋巴细胞凋亡的影响(±s，n=10)Tab.1 Effect of CMD on intestinal Peyer's patch lymphocytes apoptosis in low dose-irradiated mice (±s,n=10)

表1 西咪替丁对低剂量照射小鼠肠道PP淋巴细胞凋亡的影响(±s，n=10)Tab.1 Effect of CMD on intestinal Peyer's patch lymphocytes apoptosis in low dose-irradiated mice (±s,n=10)

NC.Normal control group; RM.Radiation model group; PC.Positive control group; CMDL.Low dose of CMD group; CMDM.Middle dose of CMD group; CMDH.High dose of CMD group.(1)P＜0.05,(2)P＜0.01 compared with NC; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with RM group

Group Apoptosis rate (%)NC 0.73±0.06 RM 1.48±0.22(2)PC 0.98±0.22(3)CMDL 1.08±0.01(1)(3)CMDM 0.85±0.17(4)CMDH 1.00±0.20(3)

2.4 对小鼠肠道PP中T、B淋巴细胞数的影响 流式细胞术检测结果显示，1.0Gy60Co γ射线照射后24h，小鼠肠道PP内T、B淋巴细胞数量均较正常对照组明显下降(P＜0.01，P＜0.05，表2)。与模型对照组比较，照射后24h，各给药组T淋巴细胞数量均明显上升，差异均有统计学意义，除了西咪替丁中剂量组以外，各给药组B淋巴数量也明显上升(P＜0.01)。

表2 西咪替丁对低剂量照射小鼠肠道PP中T、B淋巴细胞数的影响(±s，n=10)Tab.2 Effect of CMD on the T and B lymphocytes in intestinal Peyer's patch of low dose-irradiated mice (±s,n=10)

表2 西咪替丁对低剂量照射小鼠肠道PP中T、B淋巴细胞数的影响(±s，n=10)Tab.2 Effect of CMD on the T and B lymphocytes in intestinal Peyer's patch of low dose-irradiated mice (±s,n=10)

NC.Normal control group; RM.Radiation model group; PC.Positive control group; CMDL.Low dose of CMD group; CMDM.Middle dose of CMD group; CMDH.High dose of CMD group.(1)P＜0.05,(2)P＜0.01 compared with NC; (3)P＜0.05,(4)P＜0.01 compared with RM group

Group CD3+ T cells (%) CD19+ B cells (%)NC 57.66±7.16 79.96±8.93 RM 35.64±10.09(2) 67.78±6.44(1)PC 61.35±9.34(4) 82.83±3.55(4)CMDL 64.80±6.20(4) 83.80±2.39(4)CMDM 56.02±9.16(3) 75.48±8.08 CMDH 60.40±4.70(4) 82.50±4.71(4)

图3 小鼠肠免疫组织淋巴细胞凋亡情况(TUNEL ×200)Fig.3 Lymphocyte apoptosis in intestinal immune tissue of mice (TUNEL staining ×200)

3 讨 论

小肠组织对射线高度敏感，而肠黏膜屏障是肠道放射损伤的关键部位[18]。肠黏膜除了具有消化、吸收、分泌和屏障等重要功能以外，还含有丰富的免疫细胞和分子，是机体最大的免疫组织。肠黏膜免疫组织包括PP、固有层淋巴细胞(lamina propria lymphocytes，LPL)和上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes，IEL)。PP为肠黏膜免疫的传入诱导部分，LPL和IEL为效应部分，三者共同构成肠黏膜免疫屏障。研究表明，辐射损伤后肠黏膜免疫组织主要表现为淋巴细胞损失及随后的增殖反应[18]。3.0Gy γ射线照射后8h，IEL数量即减少[19]。较低剂量照射时，虽不至于发生肠型放射病，但对肠道免疫组织也会造成一定程度的损伤，继而影响肠道正常功能。

本实验观察了1.0Gy60Co γ射线照射后小鼠肠道免疫组织的病理学变化，发现仅照射模型组绒毛整体胞质着色变淡，有轻微损伤，各组PAS染色未见明显差异；TUNEL检测结果显示，照射模型组小鼠小肠组织内可见上皮细胞和淋巴细胞凋亡，以淋巴细胞为主，在固有层肠腺(隐窝)处更为明显；说明较低剂量照射对小肠组织形态结构及杯状细胞影响不大，损伤较轻，主要导致隐窝处淋巴细胞凋亡。与照射模型组比较，西咪替丁各剂量组绒毛上皮细胞排列整齐，肠形态结构整体更接近正常，仅在隐窝处见少量淋巴细胞的凋亡，表明西咪替丁能明显减少小肠免疫组织内淋巴细胞凋亡，有效改善1.0Gy60Co γ射线照射导致的轻微损伤。

肠黏膜的免疫功能包括免疫诱导和免疫应答，免疫应答的性质和程度主要取决于诱导部位的状态和功能。肠PP作为肠黏膜免疫的诱导部位，主要包括T细胞和B细胞两个功能性淋巴细胞群，对维持肠上皮屏障的完整性、调节其屏障功能具有重要意义，在肠黏膜免疫中发挥着关键作用[20-26]。因此，保护PP淋巴细胞，维护肠黏膜免疫功能，是防治较低剂量辐射导致的肠道损伤的有效手段。本实验通过流式细胞术检测1.0Gy60Co γ射线照射后小鼠肠道PP内T、B淋巴细胞数量，发现照射后24h，T、B淋巴细胞数量均明显下降，西咪替丁则能使T、B淋巴细胞数量保持稳定，说明较低剂量的γ射线即可导致肠黏膜免疫组织淋巴细胞数量减少，而西咪替丁可有效防止电离辐射诱导的T、B淋巴细胞数量下降。

已有研究发现，低或中等剂量的γ射线所致外周血淋巴细胞死亡方式主要是凋亡，电离辐射(主要是γ射线)可诱发肠免疫细胞凋亡。肠PP淋巴细胞受亚致死剂量γ射线照射后数量明显减少[27]。5.5～12.0Gy γ射线照射后，肠道PP淋巴细胞以凋亡为显著表现[28]。2002年，Kojima等[29]通过离体人外周血淋巴细胞实验，证实了西咪替丁对大剂量X射线诱导的淋巴细胞微核发生和细胞凋亡有保护作用，可以抑制辐射诱导的caspase-3凋亡途径。本次实验中，TUNEL和流式细胞术检测结果均表明1.0Gy60Co γ射线照射后24h，肠黏膜免疫组织中发生凋亡的淋巴细胞明显增加，而西咪替丁能有效抑制辐射诱导的淋巴细胞凋亡。

综上所述，西咪替丁于照射前6d连续口服给药和照射后5h内给药，可防止1.0Gy60Co γ射线导致的小鼠肠PP内T、B淋巴细胞数量减少，抑制辐射诱导的肠黏膜免疫组织中淋巴细胞凋亡，有效改善较低剂量照射小鼠引起的肠免疫组织损伤。