麦角甾醇与顺铂联合用药协同抑制人肺癌A549细胞增殖

吴梅佳，黄 挺，米完完，应园园，王航利，张梦迪，黄绳武

（1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 311402；2.杭州红十字会医院普外科，浙江杭州 310003）

肺癌是世界上发病率最多和死亡率最高的恶性肿瘤之一，在我国发病率和死亡率也占据首位，其中最常见的类型是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。由于肺癌早期诊断过于困难，大多数患者就诊时已到达中晚期。单纯手术切除的效果有限，目前放化疗、靶向治疗和免疫治疗是中晚期患者的主要治疗方式。

铂类药物因其广泛的抗癌谱和较强的抗肿瘤活性，一直是临床上治疗肺癌的重要药物之一。在目前化疗方案中，大部分需要用到铂类药物。除顺铂（cisplatin）以外，先后有卡铂、奈达铂和奥沙利铂等铂类药物在多个国家上市。但铂类药物的耐药性、无靶向性和不良反应等大大地限制了其临床应用［2］。

近年来，麦角甾醇（ergosterol，ERG）抗癌作用的相关内容陆续有报道。Yasukawa等［3］发现，ERG（从真姬菇中分离出的单体）对小鼠皮肤癌有很好的治疗作用。近期，有研究筛选了13个对11种细胞系有抗癌活性的药用菌，发现皱盖假芝提取物对癌症的抑制效果最好。对皱盖假芝提取物分离纯化，发现其中的单体ERG能诱导乳腺癌细胞凋亡［4］。Lin等［5］发现，ERG与两性霉素B联合治疗，能够有效地诱导人肝癌细胞坏死。ERG的抗肺癌作用迄今尚未见报道。

目前许多研究表明，癌细胞产生耐药与诱导聚ADP-核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1）的表达变化密切相关。有文献报道，ERG过氧化物在体外能够抑制PARP-1的活性［6］。因此推测，ERG可能具有增强顺铂对肺癌细胞A549化疗敏感性的功能。本研究通过体外培养的肺癌A549细胞，采用MTT、划痕实验、Hoechst33258染色、流式细胞术和Western蛋白质印迹等实验检测活化胱天蛋白酶3和活化PARP-1蛋白表达，探讨ERG在体外是否增加顺铂对A549细胞的敏感性，从而具有协同抗肺癌的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人NSCLC细胞A549购自中国科学院上海生命科学研究院；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司，1676918）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司，1616966）；胰酶（吉诺生物医药技术有限公司，15061103）；噻唑蓝（MTT）试剂（美国Biosharp公司，B0016K012500）；二甲亚砜（DMSO）（美国Gibco公司，WXBB3106V）；磷酸盐缓冲液（PBS）（吉诺生物医药技术有限公司，20150420）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、Hoechst33258凋亡染色试剂盒和细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Annexin V-PI流式凋亡试剂盒（美国BD公司，4293719）；兔抗鼠β肌动蛋白多克隆抗体，兔抗鼠活化胱天蛋白酶3多克隆抗体和兔抗鼠活化PARP-1多克隆抗体（美国ImmunoWay Biotechnology公司）；山羊抗兔IgG二抗（美国Rockland公司，C41217-04）；0.22 μm PVDF膜（美国Biosharp公司）；ERG对照品（含量95.5%，111845-201403），顺铂（中国食品药品检定研究院，含量99.8%，100401-201302）。

1.2 仪器

BCM-1000A生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；IX71荧光倒置显微镜和CX31光学显微镜（日本奥林巴斯公司）；AG 22331离心机（德国Eppendorf公司）；TU-100恒温金属浴（上海一恒科技有限公司）；Odyssey红外激光双色成像系统（美国LI-COR公司）；TS-1水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS124S电子分析天平〔赛多利斯科学仪器（北京）有限公司〕；MS 3 digital涡旋混合器（德国IKA公司）；DK-450B电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；层析冷柜（德国Thermo公司）；VCX500超声波破碎仪（美国SONICS公司）；TC20细胞计数器（美国Bio-Rad公司）；MLS-3750高压灭菌锅和MDF-U53V超低温冰箱（日本Sanyo公司）；MK3酶标仪（德国Thermo公司）。

1.3 MTT法检测细胞存活

对数生长期的A549细胞，以5×107L-1密度接种于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞融合达80%去上清，加入ERG 15.75，31.5，63，126和252 μmol·L-1，顺铂16.75，33.5，67，134 和 268 μmol· L-1，ERG 15.75～252 μmol·L-1+顺铂 33.5 μmol·L-1各 100 μL，细胞对照组加入100 μL培养液。每个浓度设5个复孔，分别于加药后12，24，48和72 h后进行MTT检测。每孔加入20 μL MTT溶液（5 g·L-1），37℃孵育4 h后，弃上清，每孔加入150 μL DMSO振荡15 min，采用酶标仪于492 nm处测定各孔吸光度（A492nm）值并计算抑制率。抑制率（%）=（1-A实验组/A对照组）×100%。采用SPSS软件计算不同时间点下各个药物的半数抑制率IC50值。采用q值判断ERG和顺铂联用的性质。q=EAB/（EA+EB-EA×EB），式中EA和EB为各药单用抑制率，EAB为两药合用抑制率。q＞1.15为协同作用，0.85～1.15为相加作用，＜0.85为拮抗作用。

1.4 划痕实验检测细胞侵袭迁移能力

选取作用24 h时间点下的ERG、顺铂和两药联用组浓度，细胞分为4组：细胞对照组、ERG 31.5 μmol·L-1组、顺铂 33.5 μmol·L-1组和 ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂 33.5 μmol·L-1组。取对数生长期A549细胞，以1.5×108L-1的细胞密度接种于6孔板中，每孔2 mL，于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞融合达80%。待细胞铺满，用PBS洗细胞3次。各组给药以后，显微镜下拍照，记录0 h时刻痕迹。放入37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，显微镜下拍照，记录24 h时刻痕迹，计算划痕宽度缩短率。划痕宽度缩短率（%）=（1-24 h宽度/0 h宽度）×100%。

1.5 Hoechst33258染色检测细胞凋亡

药物分组同1.4项所述。24 h后PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室温固定20 min，吸出甲醛，PBS清洗3次，加入Hoechst33258染液，37℃染色30 min，滴入抗荧光淬灭剂后封片，于荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期

1.6.1 细胞凋亡率测定

药物分组同1.4项所述。24 h后收集上清及细胞，100×g离心5 min后弃去上清，预冷的PBS洗涤3次后用100 μL 1×流式缓冲液重悬，采用AnnexinⅤ-PI双染流式细胞术检测各组凋亡情况。每个给药孔加入5 μL FITC与5 μL PI荧光染料，于室温下黑暗处孵育15 min，每孔加入400 μL 1×缓冲液，用涡旋混合器低转速下混合均匀，在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6.2 细胞周期测定

药物分组同1.4项所述。药物作用24 h后，收集上清及细胞，200×g离心10 min，PBS洗涤1次后，用75%乙醇固定过夜，离心弃掉乙醇，用PBS洗涤2次，将细胞重悬于300 μL PBS中，加入PI，室温避光染色30 min，置流式细胞仪上测定各周期细胞比例。

1.7 Western蛋白质印迹法检测活化的胱天蛋白酶3和PARP-1蛋白表达

药物分组同1.4项所述。24 h后收集上清及细胞，提取细胞总蛋白。用BCA法测定总蛋白浓度，调整各个样品的上样量一致，将蛋白质样品与2×上样缓冲液以体积比1∶1混合后于100℃金属浴中煮沸5 min，加入相应浓度的SDS-PAGE胶，电泳至溴酚蓝距离胶底部1 cm处即停止电泳，然后电转移至0.22 μm的PVDF膜上，5%BSA封闭1 h，稍洗后分别加入适量活化胱天蛋白酶3（1∶500）、活化PARP-1（1∶1000）和β肌动蛋白（1∶2000）一抗于4℃下孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入对应来源的荧光二抗，常温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，采用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫膜并定量分析条带的积分吸光值。以目标蛋白和内参蛋白的积分吸光度的比值表示蛋白相对表达水平。

1.8 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，实验重复3次。采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，采用单因素方差分析法，两组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERG与顺铂联合用药对A549细胞的抑制作用

ERG 15.75～252 μmol·L-1和顺铂 16.75～268 μmol·L-1均能抑制A549细胞的生长且呈浓度依赖性。在不同药物作用时间点下，ERG 15.75～252 μmol·L-1+顺铂 33.5 μmol·L-1各组对 A549 细胞的抑制率相较于ERG 15.75～252 μmol·L-1及顺铂（33.5 μmol·L-1）单用组均有显著提高（P＜0.05，P＜0.01），表明ERG与顺铂联用明显增强了顺铂对A549的敏感性（表1和表2）。顺铂单用组IC50值在24 h时为35.68 μmol·L-1，考虑到ERG作为一个中药单体，与顺铂联用的目的在于增效减毒，以期降低顺铂用量的同时，并不降低其药效甚至达到更好的药效。因此，用于后续实验的两药联用组中顺铂的浓度确定为 33.5 μmol·L-1。ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组在12，24，48和72 h，q值分别为1.04，1.16，1.05和0.97。表明ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5μmol·L-1组在作用时间为24h时，具有协同作用。

Tab.1 Effect of ergosterol(ERG)combined with cisplatin on A549 cell viability

Tab.2 Effect of ERG combined with cisplatin on IC50at different time points

2.2 ERG与顺铂联合用药对A549细胞侵袭迁移能力的影响

划痕实验结果显示（图1），细胞划痕24 h后,各组划痕宽度缩短率分别为（23±3）%，（20±5）%，（5±4）%和（41±6）%。与细胞对照组相比，ERG 31.5 μmol·L-1组和顺铂 33.5 μmol·L-1组的划痕直径缩短率明显减小（P＜0.01），ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组的划痕直径缩短率最小，细胞基本无迁移现象。表明两药联用相较于药物单用组，能极显著减弱A549细胞的侵袭迁移能力。

Fig.1 Effect of ERG combined with cisplatin on migra⁃tion ability of A549 cells by inverted microscope.The cells were treated with drugs for 24 h.↔:the width of scratching boundary.

2.3 ERG与顺铂联合用药对A549细胞凋亡和细胞周期的影响

2.3.1 Hoechst33258染色结果

Hoechst33258染色结果见图2，在荧光显微镜下观察，细胞对照组的细胞发出较弱的蓝色荧光，细胞核大小较均一，染色质分布均一，无明显的形态学改变；而实验组凋亡细胞形态学明显改变，出现核浓染、碎裂，形状不规则，大小不一，发出亮蓝色荧光（图中白色箭头指向处）。ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组出现凋亡样的细胞数量明显多于二者单用组，表明两药联用能有效诱导A549细胞凋亡。

Fig.2 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by inverted microscope.See Fig.1 for the treatment.Arrows show the apoptotic cells.

2.3.2 流式仪检测结果

细胞凋亡情况结果如表3和图3所示，单用顺铂组的细胞凋亡率在各个浓度下均要高于单用ERG组，而两药联用组的凋亡率均显著高于相同浓度下单用药组（P＜0.01），且ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组细胞凋亡率最高，表明ERG和顺铂联用能促进A549细胞凋亡。

Tab.3 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by flow cytometry

Fig.3 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell apoptosis by flow cytometry after 24 h treatment.

2.3.3 ERG与顺铂联合用药对A549细胞周期的影响

图4结果表明，当ERG浓度为31.5 μmol·L-1时，对A549细胞周期产生明显的G0/G1期阻滞，G0/G1期比例为（85.3±2.0）%，与细胞对照组（70.4±2.0）%相比明显升高（P＜0.01）。而顺铂33.5 μmol·L-1可阻滞A549细胞周期于S期，比例为（41.5±2.5）%，与细胞对照组（12.7±0.9）%相比明显升高（P＜0.01）。两药联用时，A549细胞G2/M期比例增加为（20.0±1.5）%，与细胞对照组（15.8±1.3）%相比明显升高（P＜0.05），表明两药联用可能通过将A549细胞阻滞在G2/M期来抑制其增殖。

Fig.4 Effect of ERG combined with cisplatin on A549 cell cycle by flow cytometry.See Tab.3 for the treatment.

2.4 ERG与顺铂联合用药对A549细胞内凋亡相关蛋白的影响

实验得到蛋白标准曲线为Y=0.0043X+0.0663，R2=0.9999，线性范围为2.273～45.455 mg·L-1。Western蛋白质印迹结果如图5所示，与细胞对照组相比，ERG 31.5 μmol·L-1能够显著上调 A549 细胞胞浆活化胱天蛋白酶3蛋白的表达（P＜0.05），而顺铂 33.5 μmol·L-1及 ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1均能够极显著上调活化胱天蛋白酶3蛋白的表达（P＜0.01）；与单独用药组相比，二者联合给药后活化胱天蛋白酶3蛋白的表达与单一用药组相比显著上调（P＜0.01）。活化PARP-1蛋白的表达结果中，与细胞对照组相比可知，ERG 31.5 μmol·L-1不能引起A549细胞凋亡相关蛋白活化PARP-1蛋白表达的增加，而顺铂33.5 μmol·L-1及 ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂 33.5 μmol·L-1均能增加活化 PARP-1蛋白的表达（P＜0.01）；与顺铂33.5 μmol·L-1组相比，ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组给药后活化PARP-1蛋白的表达显著上调（P＜0.01）。ERG 31.5 μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1组执行凋亡的活化胱天蛋白酶3和活化PARP-1蛋白明显增多，表明两药联用能显著诱导细胞的凋亡。

Fig.5 Effect of ERG combined with cisplatin on protein expression of cleaved caspase 3（A，B）and cleaved poly ADP-ribose polymerase-1(PARP-1)（A，C）in A549 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative result of A，respectively.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with ERG 31.5 μmol·L-1group；△△P＜0.01，compared with cisplatin 33.5 μmol·L-1group.

3 讨论

本研究结果表明，ERG的浓度在15.75～252 μmol·L-1，顺铂的浓度在16.75～268 μmol·L-1，ERG（15.75～33.5）μmol·L-1+顺铂33.5 μmol·L-1，对A549细胞有一定的增殖抑制作用，且呈较好的量效关系。ERG 31.5 μmol·L-1和顺铂 33.5 μmol·L-1联合给药具有协同作用。采用流式细胞仪检测发现，ERG与顺铂联用的凋亡率明显高于ERG和顺铂单用。且随着药物浓度的增加，细胞早期凋亡率呈现增加的趋势。由于许多中药成分会通过影响细胞周期来发挥抗癌作用［7-8］，本研究着重考察了ERG对A549细胞周期的影响。ERG 31.5 μmol·L-1能引起A549细胞G0/G1期的细胞增多和S期细胞的减少，顺铂 33.5 μmol·L-1单用能引起A549细胞G0/G1期的细胞减少和S期细胞的增多，ERG 31.5 μmol·L-1和顺铂 33.5 μmol·L-1联合给药能引起A549细胞G0/G1期、S期细胞减少和G2/M期细胞的增多，表明两药联用可能通过导致细胞G2/M期阻滞抑制其增殖，从而抑制肺癌的发生和发展。

已有研究报道，PARP-1作为第一个被发现的细胞凋亡蛋白酶亚基，其参与的细胞死亡是通过从线粒体中释放凋亡蛋白或消耗细胞质中NAD+来实现的［9］。凋亡蛋白胱天蛋白酶7和胱天蛋白酶3在胱天蛋白酶断裂位点（DEVD）将PARP-1切割成分子量为89和27 ku的2个片段［10］。PARP-1断裂后，PARP-1不仅失去了催化活性［11］，而且使细胞内能量不被耗尽，继而保证细胞凋亡过程中的能量供应［12］。本研究发现，ERG与顺铂联合用药能上调活化胱天蛋白酶3，活化PARP-1的表达也随之增多，导致活化胱天蛋白酶3下游的PARP-1由于酶切作用而活性被抑制，可以推断PARP-1的抑制可能是胱天蛋白酶信号通路中的一个普遍的机制。关于胱天蛋白酶介导的PARP-1活性抑制的作用，则是为了抑制后者对DNA片段化水解的顺利进行以及凋亡过程中的能量供给［13］。完整的胱天蛋白酶信号通路凋亡机制需要进一步深入研究。ERG与顺铂联用在其他肺癌细胞系上的增殖抑制作用研究，尚需进一步深入探讨。

综上所述，降低顺铂的用量，与ERG联用可显著抑制肺癌A549细胞增殖及迁移，进而诱导细胞凋亡。从肿瘤化疗角度看，药物联用对于降低抗肿瘤药物毒性具有重要的临床意义，这一结果为指导临床用药提供了一定的参考。