二至丸对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的防护作用及机制

段冷昕，高 杨，胡 举，赵亚飞，吴欣芳，王建刚

（河南科技大学医学院药理学与分子生物学重点实验室，河南洛阳 471023）

二至丸出自明·王三才的《医便》，由女贞子（酒蒸）和墨旱莲2味中药等量（1∶1）制成。二至丸具有益肝肾、补阴血、壮筋骨、乌须发的功效，是平肝补肾的经典方剂［1］。现代研究表明，二至丸具有保肝、抗纤维化、增强免疫力、降血脂、改善缺铁性贫血、抗骨质疏松以及抗肿瘤等多种药理活性［2］。

四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）是目前最为常用的诱导急性肝损伤的药物，作用机制十分复杂。CCl4能诱导细胞内代谢产生大量的活性氧类（reactive oxygen species，ROS），ROS能够引起细胞膜和细胞器膜的过氧化，进而损伤内质网，导致错误折叠蛋白在内质网腔内聚集，引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［3-4］。因此，CCl4诱导的肝损伤和ERS密切相关。

研究发现，二至丸的乙酸乙酯提取部分及醇提物均能显著改善急性肝损伤模型小鼠血清中谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transferase，GPT）、谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transferase，GOT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等指标［5-6］，表明二至丸提取物对小鼠肝损伤有一定的预保护作用，但目前有关二至丸保肝作用机制的深入研究报道较少。本研究旨在探讨二至丸对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的预防作用及可能的分子机制，为二至丸的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

女贞子和墨旱莲均购自北京同仁堂；二至丸参照文献［7］制得：女贞子（蒸）500 g，墨旱莲500 g，将女贞子粉碎成细粉，墨旱莲加水煎煮2次，每次1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量，加炼蜜60 g及水适量，与上述粉末泛丸，干燥，即得。出膏率约为42%。GPT、GOT、MDA、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和SOD试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；TUNEL试剂盒购自美国Roche公司；兔抗鼠IgG-免疫组化试剂盒购自博士德生物工程有限公司；兔抗鼠葡糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）多抗购自美国Abcam公司；兔抗鼠CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homolo⁃gous protein，CHOP）多抗、兔抗鼠β肌动蛋白多抗和HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自美国Proteintech Group公司；CCl4购自天津市富宇精细化工有限公司。

TGL-16G高速冷冻离心机（上海安宁科学仪器厂）；蛋白电泳及转膜系统（美国Bio Rad）；电子分析天平（美国Mettler-Toledo公司）；Leica RM2128切片机（德国Leica公司）；Motic生物显微镜B310-T（中国厦门麦克奥迪实业集团有限公司）；SHY-2水浴恒温振荡器（中国金坛市迅生仪器厂）。

1.2 动物、分组和处理

50只清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2010-0007，饲养温度18～22℃，光照12 h，相对湿度50%～60%，自由摄食饮水。

小鼠随机分为正常对照组、模型组和二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1组（ig，每天1次，连续14 d），正常对照组和模型组以同样方式给予生理盐水。末次给药8 h后，除正常对照组外，其余各组小鼠ip给予10%CCl4溶液10 mL·kg-1（用豆油稀释）［8］，24 h后摘除眼球取血，而后处死小鼠，取肝和脾进行指标测定。

1.3 血清生化指标检测

摘除眼球取血后，825×g离心10min制备血清，按照试剂盒说明测定GPT，GOT，SOD，MDA和GPX。

1.4 脏器指数计算

称取肝、脾质量和体质量，计算脏器指数。脏器指数=脏器质量（g）/体质量（g）×100。

1.5 HE染色观察肝组织病理变化

取小鼠肝左叶部位［9］，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，制成5 μm切片后进行常规HE染色，光学显微镜下观察肝组织的病理变化。

1.6 TUNEL法检测肝细胞凋亡

按照试剂盒说明书，将肝组织切片依次脱蜡，水化，蛋白酶K 37℃通透30 min，PBS漂洗3次，加TUNEL反应混合液（TdT：荧光素标记的dUTP=1∶9）进行标记反应，37℃恒温箱孵育30 min后进行DAB显色，脱水，透明，封片。以细胞核呈棕褐色为凋亡细胞阳性染色。在光学显微镜下随机选取5个不同的视野进行细胞计数。凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.7 免疫组化法检测CHOP和GRP78蛋白表达

将组织切片经脱蜡，水化，抗原热修复后，以5%BSA 37℃ 封 闭 30 min，加 一 抗（GRP78：1∶250；CHOP：1∶50）4℃过夜，PBS清洗3次，每次5 min，加二抗37℃孵育30 min，PBS清洗后DAB显色，苏木精复染45 s，脱水，透明，封片，拍照。利用Image Pro Plus6.0软件分析其吸光度比值。

1.8 Western蛋白质印迹法检测CHOP和GRP78水平

取肝组织100 mg，加入RIPA裂解液1 mL，于冰上研磨裂解后离心得肝总蛋白，用BCA法进行蛋白定量，取蛋白样品80 μg进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜（200 mA，120 min），5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，加一抗 4℃过夜（CHOP：1∶500；GRP78：1∶1000；β肌动蛋白：1∶5000），TBST洗3次，每次5 min，加入HRP标记的二抗（1∶1000），37℃孵育1 h，ECL发光显色，采用Gel-Pro Analyzer分析蛋白条带积分吸光度，以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度的比值表示其相对表达水平。

1.9 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二至丸对CCl4致急性肝损伤小鼠血清GPT，GOT，SOD和GPX活性及MDA含量的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠血清中GPT和GOT活性及MDA含量显著升高（P＜0.01），SOD和GPX活性显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，二至丸各剂量组小鼠血清中GPT和GOT活性及MDA含量均明显降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD和GPX活性显著升高（P＜0.01），并呈剂量依赖性（r=0.83，P＜0.05）。

Tab.1 Effect of Erzhi pill on content of malondialdehyde（MDA）and activity of glutamic-oxaloacetic transferase（GOT），glutamic-pyruvic transferase（GPT），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPX）in serum of mice with carbon tetrachloride（CCl4）-induced acute liver injury

2.2 二至丸对CCl4致急性肝损伤小鼠肝指数和脾指数的影响

与正常对照组相比，模型组肝指数明显增加（P＜0.01），脾指数显著减小（P＜0.01）；与模型组相比，二至丸各剂量组肝和脾系数有不同程度改善，其中2.8和5.6 g·kg-1组差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

Tab.2 Effect of Erzhi pill on index of liver and spleen of mice with CCl4-induced acute liver injury

2.3 二至丸对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织结构的影响

正常对照组小鼠肝细胞索排列规则，肝小叶结构正常，肝细胞无坏死、变性，无炎症细胞浸润。与正常对照组相比，模型组肝组织结构紊乱，胞质疏松，出现明显的炎症细胞浸润以及片状坏死和气球样变。与模型组相比，二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1组小鼠肝细胞炎症反应不同程度减轻（图1）。

2.4 二至丸对CCl4致急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响

Fig.1 Effect of Erzhi pill on histopathological changes of hepatocytes in mice with CCl4-induced acute liver injury by HE staining.See Tab.1 for the mouse treatment.The arrows show lesion locations.

与正常对照组相比，模型组小鼠肝细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，二至丸各剂量组肝细胞凋亡率显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且呈剂量依赖性（r=0.99，P＜0.01）（图2）。

2.5 二至丸对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织GRP78和CHOP表达的影响

免疫组化（图3和4）和Western蛋白质印迹结果（图5）显示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝细胞中CHOP和GRP78的表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，二至丸1.4，2.8和5.6 g·kg-1组CHOP表达显著下降（P＜0.01），二至丸2.8和5.6 g·kg-1组GRP78表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01），1.4 g·kg-1组GRP78表达差异无统计学意义。

Fig.2 Effect of Erzhi pill on apoptosis of hepatocytes in mices with CCl4-induced acute liver injury by TUNEL assay.See Tab.1 for the mouse treatment.The apoptosis rate（%）=the number of apoptotic cells/the total number of cells×100%.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01,compared with model group.

Fig.3 Effect of Erzhi pill on expression of CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by immunohistochemical assay.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；##P＜0.01,compared with model group.

Fig.4 Effect of Erzhi pill on expression of glucose regulated protein 78(GRP78)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by immunohistochemical assay.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01,compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01,compared with model group.

Fig.5 Effect of Erzhi pill on expression of CHOP(A,B)and GRP78(A,C)in hepatocytes of mice with CCl4-induced acute liver injury by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B and C were the semi-quantita⁃tive results of A.±s,n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01,compared with model group.

3 讨论

CCl4在肝内经微粒体细胞色素P450分解活化，生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基，导致肝微粒体脂质过氧化，进而导致肝细胞膜通透性增高，血清中GPT和GPT活性显著升高，因此GPT和GOT活性常被用来作为检测急性肝损伤的指标［10］。GPX和SOD可以减轻和消除氧化损伤，清除自由基，是体内重要的抗氧化物质［11］。MDA是反映脂质过氧化程度和氧化应激情况的重要生物指标之一。闫冰等［12-14］研究发现，采用二至丸不同的保肝活性组分预保护给药后，腹腔注射CCl4诱导小鼠急性肝损伤，二至丸不同的保肝活性成分均能够降低血清中GPT和GOT的活性，降低MDA的含量，增强SOD的活性。本研究中采用二至丸整方ig给药，发现同样可明显降低血清中GPT和GOT活性及MDA含量，升高SOD和GPX活性，并呈剂量依赖性。HE染色结果表明，二至丸各剂量组的小鼠肝坏死程度随着给药剂量的增加逐渐减轻。由此可见，二至丸能减轻氧化应激所致的小鼠肝损伤。

CCl4代谢产生大量的ROS能够引起细胞膜和细胞器膜的过氧化，进而损伤内质网，导致ERS［15］。在ERS发生的早期，细胞通过上调GRP78的表达、加速未折叠或错误折叠蛋白的降解、抑制蛋白质合成等途径缓解ERS，恢复内质网功能，促进细胞存活；过度剧烈或持续时间较长的ERS将激活下游相应的凋亡信号通路，促进细胞凋亡，而CHOP是ERS与细胞凋亡之间的重要信号分子，GRP78和CHOP表达水平的上升是ERS所致细胞凋亡发生的标志之一［16-18］。本研究结果显示，二至丸各给药组剂量依赖性地降低CCl4所致肝细胞凋亡率；免疫组化和Western蛋白质印迹结果显示，二至丸各剂量组均能显著逆转CCl4致急性肝损伤小鼠肝细胞CHOP蛋白的升高，二至丸5.6 g·kg-1组能显著逆转GRP78蛋白的升高，表明二至丸可通过抑制CHOP和GRP78的表达，减轻CCl4引起的ERS，减少细胞凋亡。

综上，二至丸对CCl4所致的急性肝损伤具有预防作用，其机制可能与其抗氧化应激和缓解ERS有关。本研究结果为深入研究二至丸的保肝作用及其临床应用提供了实验依据。