不同物质修饰的阳离子脂质体的研究进展

冯莹莹，胡海梅

（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006）

自20世纪80年代以来，基因治疗已被用于许多疾病中。然而，基因试剂由于其聚阴离子性质而几乎不能渗透到细胞中，使基因治疗受到了阻碍［1］。用于基因治疗的载体主要有病毒基因载体和非病毒基因载体。病毒基因载体转染效率明显增高，但也存在安全性低、负载能力小和出现免疫反应等缺点。非病毒载体由于其安全性和生物相容性好、易获取和结构稳定等优越性，受到越来越多的关注［2］。阳离子脂质体是非病毒基因载体中研究比较多的一种。阳离子脂质体带正电荷，与内涵体中带负电荷的膜脂质发生静电相互作用，膜脂质由内涵体的腔外翻转到腔内，与正电荷形成中性电子对，基因药物脱离阳离子脂质体进入细胞核。阳离子脂质体由3部分组成，即亲水性头部，链接键和疏水性尾部。

近几年，对阳离子脂质体的研究主要是通过对其结构和表面的修饰，提高其转染效率，提高生物降解性，降低其细胞毒性，从而提高基因治疗效果。本文将主要就糖类物质、氨基酸及多肽、酒石酸、环类化合物和叶酸等修饰的阳离子脂质体进行介绍和分析。

1 糖类物质修饰的阳离子脂质体

天然存在的糖类物质如氨基葡萄糖、甘露糖和葡萄糖等具有羟基和氨基，可被改造和修饰。具有生物相容性的壳聚糖及体内存在的酸性黏性多糖和透明质酸也被广泛应用于脂质体的修饰中。Peng［3］以氨基葡萄糖为骨架，疏水链通过长度为3个碳原子的连接臂与氨基葡萄糖相连，合成一系列具有不同疏水链长度的氨基葡萄糖阳离子脂质体。实验发现，该阳离子脂质体粒径范围是80～150 nm，zeta电位为38～60 mV，在HEK293细胞（人胚肾细胞）和HepG2细胞（肝癌细胞）中具有很高的转染效率和较低的细胞毒性。Deng［4］以甘露糖为骨架，合成了疏水链分别与甘露糖糖环和甘露糖头基相连的甘露糖阳离子脂质体。实验发现，疏水链与糖环链接的阳离子脂质体在细胞转染实验中无转染，而疏水链与甘露糖头基相连的阳离子脂质体在HepG2细胞和HeLa细胞（子宫颈癌细胞）的转染效率几乎跟脂质体的转染效率相同。He等［5］以葡萄糖为原料，合成疏水链与葡萄糖季铵盐氮原子相连的阳离子脂质体。实验发现，该阳离子脂质体平均粒径为90～180 nm，zeta电位在10～40 mV之间，与脂质体2000相比，该阳离子脂质体在HEK293细胞中具有更高的转染效率。以上3个合成都是通过单糖对阳离子脂质体头部进行修饰，合成中疏水链与氨基葡萄糖的连接点对转染效率有很大的影响，若疏水链直接与糖环相连，会影响单糖的特异性识别能力。脂质体疏水链与单糖季铵盐的氮相连不仅具有更高的转染效率，还保留了游离单糖的属性，不会损害细胞的新陈代谢。

壳聚糖是一种天然阳离子多糖，具有低毒性、生物相容性、生物可降解性、生物黏附性和表面活性基团多等特点。Saesoo等［6］合成两亲性壳聚糖衍生物，季铵化N，O-油酰壳聚糖（quaternized N，O-oleoyl chitosan，QCS），并将其掺入到脂质体囊泡中，合成QCS-脂质体，该阳离子脂质体粒径为（171.5±0.8）nm，电位为（11.7±0.7）mV，并在HeLa细胞中具有很高的转染效率。表面有QCS修饰的阳离子脂质体具有更强的黏膜黏附性质和靶向性，表面的QCS使阳离子脂质体具有更强的正电荷，能更好地与细胞结合。壳聚糖的无毒性和生物相容性使该阳离子脂质体具有较低的细胞毒性，可用于持续药物释放，能有效传递宫颈癌药物到体内。

通明质酸是一种在生命体系中天然存在的、由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的双糖单位反复交替连接构成的线性大分子黏多糖，具有无毒性、无免疫原性、无致炎性、生物相容性好和生物可降解等优点，并能与细胞表面某些特异受体结合，在体内循环过程中，能通过增强肿瘤组织透过性和滞留效应增加治疗药物在肿瘤部位的浓度，实现肿瘤靶向治疗。Fan等［7］将（2，3-二油酰基-丙基）-三甲胺（1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP）与通明质酸结合，制备了新型阳离子脂质体，该阳离子脂质体的细胞毒性比普通DOTAP阳离子脂质体减少了20倍。Ran等［8］合成了一种由通明质酸修饰的连接有聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的阳离子脂质体，该阳离子脂质体具有更高的生物相容性和血清稳定性，转染效率高且有很好的肿瘤细胞积累能力。Chen等［9］通过静电作用在阳离子脂质体表面涂布一层通明质酸对其进行修饰，该涂层显著减少甚至逆转表面正电荷，从而提高该脂质体的稳定性和细胞相容性。通过对不同细胞系的转染效率的研究表明，该阳离子脂质体显示出较高的转染效率。Han等［10］将通明质酸通过共价键连接到脂质体的表面，以紫杉醇为模型药物，对其体内外肿瘤靶向性和治疗效果进行评价。定量和定性的细胞摄取实验证明了通明质酸脂质体与肿瘤干细胞具有良好的结合能力，通明质酸修饰脂质体能增强其入胞能力。通过MTT实验验证脂质体的细胞毒性与肿瘤干细胞对脂质体的摄取量成正相关性。Zhao等［11］以通明质酸为主动靶向配体，脂质体为药物载体，构建了通明质酸修饰的绿原酸脂质体，用以改善绿原酸脂质体自身理化性质的局限，从而达到增强绿原酸脂质体抑制肿瘤作用的目的。实验证明，与游离绿原酸脂质体相比，通明质酸修饰的绿原酸脂质体能增强其对A549细胞和HepG2细胞的细胞毒性。通明质酸一般通过3种方式作为基因传递系统：①通过共价键的方式与脂质体结合；②直接作为药物载体，既可保护DNA又可减少不良反应出现；③对脂质体进行表面修饰，无论用何种方式对阳离子脂质体进行修饰，都能增强脂质体的靶向性和延长药物在体内的作用时间。

Li等［12］成功合成了麦芽糖修饰的具有不同疏水链的阳离子脂质体，并对其结构活性进行研究，通过凝胶阻滞实验和动态光散射仪的测定，该脂质体能有效压缩DNA并具有合适的粒径。通过增强性绿色荧光蛋白在细胞中的表达，表明该脂质体具有很高的转染效率。而且MTT实验证明该脂质体具有较低的细胞毒性和较高的生物相容性。Oh等［13］合成了半乳糖修饰的阳离子脂质体，实验结果表明，这类阳离子脂质体能有效将药物和目的基因转染到癌细胞，特别是肝癌细胞。

2 氨基酸及多肽修饰的阳离子脂质体

由氨基酸或多肽修饰的阳离子脂质体，是一类新型的阳离子脂质体，具有生物相容性好，生物降解能力高，细胞靶向性等优点，并且能促进脂质体与DNA的结合。Fu等［14］采用固相合成法合成了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）三肽，并与中间体化合物连接得到了RGD肽型阳离子脂质体，将所制备的RGD肽型阳离子脂质体运载质粒DNA转染HeLa细胞。结果表明，当脂质体与DNA的质量比约为3∶1时，脂质体与二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1∶1时，阳离子脂质体达到了最高转染效率，其转染效果与商品化的转染试剂DOTAP和脂质体2000相当，MTT实验表明，该阳离子脂质体对HeLa细胞的毒性较低，其细胞存活率均＞80%。Zhao等［15］合成了几种新型三肽阳离子脂质体，用于输送DNA和siRNA。以赖氨酸和鸟氨酸作为头组，氨基甲酸盐为连接键，并对这些三肽阳离子脂质体的物理性质和基因传递进行研究。实验结果表明，它们的颗粒大小、zeta电位和DNA结合都表明它们适合基因转染。进一步的结果表明，这些脂质可很有效地将DNA和siRNA转染到NCI-H460和HepG2肿瘤细胞，并且体外和体内的毒性作用很小。Zheng等［16］合成了一系列氨基酸与酰基键相连作为亲水性头部的阳离子脂质体。实验证明，以苯丙氨酸为头部的阳离子脂质体具有良好的生物相容性，细胞存活率高于脂质体。研究表明，血清中的阴离子成分可能通过与带正电的阳离子载体相结合来干扰转染过程。实验结果表明，在10%血清条件下，该阳离子脂质体的转染效率要高于相对分子质量为25 000的聚乙烯亚胺。Ju等［17］合成了天然赖氨酸和组氨酸修饰的阳离子脂质体，通过凝胶阻滞实验、细胞毒性实验和细胞转染表明，该赖氨酸和组氨酸修饰的阳离子脂质体能很好地压缩DNA、具有较低的细胞毒性、并将目的基因转入到293T细胞（人肾上皮细胞）中高效率的表达。Su等［18］设计合成了几种脂酸功能化的以不同氨基酸为头部的阳离子脂质体，并研究其不同的结构对阳离子脂质体的生物性能的影响。结果表明，亲水性头部对转染效率有很大的影响，其中精氨酸为头部的阳离子脂质体的转染效率最高。

Liu等［19］将含咪唑基的组氨酸缩合形成一个二肽为头部的阳离子脂质体，该阳离子脂质体具有良好的pH缓冲能力，能有效地将pDNA转染到HeLa细胞中，从而达到更高的转染活性。

3 酒石酸修饰的阳离子脂质体

酒石酸是一种多功能分子，具有2个羟基和2个羧基作为反应位点，一般用做阳离子脂质体的主干部分，修饰亲水性头部或烷基尾部。Wan等［20］以酒石酸为骨架，以6-氨基己酸和饱和烃链十二醇和十六醇为原料，分别合成了2种新型阳离子脂质体，并考察了阳离子脂质体的理化性质、凝胶电泳、转染活性和细胞毒性。实验表明，用酒石酸为骨架制备的阳离子脂质体的转染活性高和细胞毒性低。Jia等［21］以天然产物酒石酸为骨架，在酒石酸羟基端引入氨基己酸为阳离子头部，在其羧基端引入不同长度的疏水链制备得到新型阳离子脂质体，阳离子脂质体粒径及zeta电位测定结果表明，所制备的阳离子脂质体粒径均＜150 nm，zeta电位均＞35 mV。MTT实验结果表明，所设计的阳离子脂质材料毒性较低，具有较好的生物相容性，满足基因递送载体的要求。

4 环类化合物修饰的阳离子脂质体

研究发现，环状化合物如大环多胺、苯并噻唑和咪唑基等修饰的阳离子脂质体具有更好的性能，如高转染率和低细胞毒性等。Mével等［22］设计合成了以一个咪唑基为亲水头部的阳离子脂质体和通过酰胺键连接2个咪唑基为亲水头部的阳离子脂质体，并考察其形态和转染效率。实验表明，该阳离子脂质体在HEK细胞中的转染效率高于脂质体。Kedika等［23］以一系列由不同基团修饰的苯并噻唑作为阳离子脂质体的亲水性头部，将制备的脂质体与绿色荧光蛋白质粒DNA混合，转染人黑色素瘤癌细胞B16F10、人肺癌细胞（A-549）和人乳腺癌细胞（MCF-7）。结果表明，不同的基团修饰的苯并噻唑阳离子脂质体的转染效率和细胞毒性不同，但以苯并噻唑为头部的阳离子脂质体比一般阳离子脂质体的转染效率高，并且在血清条件下也能有效转染。Huang等［24］设计含不同脂肪链的以大环多胺咪唑基为亲水性头部的阳离子脂质体，实验发现，咪唑基可使阳离子脂质体的转染效率大大提高。大环多胺咪唑类阳离子脂质体是一类新型有效的非病毒基因载体，该脂质体表现出良好的稳定性，并可将质粒DNA压缩成粒径100～250 nm的正电位（10～25 mV）纳米颗粒。与市售的脂质体2000相比，该脂质体的细胞毒性相对较低且具有较高的转染效率。Zheng等［25］合成了一系列以2-氨基环己基修饰亲水头部的阳离子脂质体，实验表明，这类阳离子脂质体在B16F1和HeLa细胞中有很高的转染效率和较小的细胞毒性。Gao等［26］合成了萘二甲酰亚胺修饰亲水头部的阳离子脂质体，体外转染表明，该脂质体能将质粒DNA传送到测试的细胞株中，且该阳离子脂质体的转染效率比脂质体2000高，在10%血清中转染效率显著增加，为开发新的高性能基因载体提供了参考。Wang等［27］合成了一系列由赖氨酸衍生的具有刚性芳环为连接键的阳离子脂质体并利用增强的绿色荧光蛋白作为报告基因进行基因转染活性。实验发现，该脂质体能将DNA压缩为纳米级别大小，并在有血清条件下保持较高的基因表达水平。脂质中的刚性芳香成分在基因转染中起着重要的作用，可有效地提高载体材料的血清耐受性。

5 叶酸修饰的阳离子脂质体

叶酸对叶酸受体的亲和力很高。叶酸可作为肿瘤活性靶向配体，已被用于卵巢癌、结肠癌和肺癌等癌症的治疗［28-30］。利用叶酸偶联的阳离子脂质体提高其靶向性，基因转染效率，同时降低脂质体对正常细胞的毒性［31-33］。Jin等［34］将叶酸连接在脂质体的表面，制备出叶酸和精氨酸双修饰阳离子脂质体。实验结果显示，双修饰后的脂质体载体能较高效率地将siRNA转染进入肿瘤细胞，导致细胞凋亡或死亡，而未载药的脂质体无明显毒性，表明脂质体载体安全可靠。Cui等［35］合成了一种以叶酸作为靶向配体，以胆固醇作为辅助脂质的新型阳离子脂质体。经测定，该阳离子脂质体的粒径为100～150 nm，细胞转染实验表明，当叶酸的浓度为100 mg·L-1，该阳离子脂质体在NCI-H460细胞中的转染效率与脂质体2000相当。实验发现叶酸可提高该阳离子脂质体的基因转染效率，而且添加叶酸不会诱发任何细胞毒性。

6 以氨基甲酸酯为连接键的阳离子脂质体

阳离子脂质体的连接键对其稳定性有很大的影响，稳定性太低会使基因药物还未达治疗点就核酶降解，无法发挥作用。若稳定性太高难以降解，会积累产生较大的细胞毒性［36］。以氨基甲酸酯为连接键的阳离子脂质体，具有适合的降解能力。Shi等［37］制备一系列具有不同链长或不饱和度的疏水链氨基甲酸酯连接的阳离子脂质体，并研究其在HeLa，HepG2和NCI-H460细胞中的转染效率。结果表明，疏水尾部长度为12和14个碳原子饱和链的阳离子脂质体的转染效率高于16和18碳原子饱和链，而尾部为不饱和18碳链的阳离子脂质体的转染效率高于不饱和18碳链。这些结果可能是由于较短的碳氢化合物链增加了双层结构的流动性。Zhao等［38］合成了一系列具有氨基甲酸酯链的阳离子脂质体，它们以12，14，16和18个碳原子的碳氢链为尾部，分别命名为G12，G14，G16和G18，制备成阳离子脂质体，并研究其理化性质和基因传递。在同系列脂质体中，结合能力随尾长的增加而下降，并对HepG2和A549细胞进行细胞毒性和转染效率测试。实验结果表明，这类阳离子脂质体的转染效率更高，并且其细胞毒性低于脂质体2000。

7 其他化合物修饰的阳离子脂质体

除上述物质外，许多物质也被发现能通过对阳离子脂质体的结构和表面进行修饰来改善阳离子脂质体的细胞毒性和增强基因传递。Luo等［39］设计了一种以二甲双胍为头部的新型阳离子脂质体，并测定了其在H460细胞的毒性及其抗肿瘤活性。实验结果表明，该阳离子脂质体具有较低的细胞毒性，而且在小鼠体内表现出明显的抗肿瘤活性，能延缓肿瘤的生长和增殖。蔗糖酯是一种具有良好的药物溶出的天然可生物降解赋形剂，具有抗肿瘤活性，抗菌性能，毒性低、无抗原性、生物降解性等，近年来被广泛用于在医药领域。Zhao等［40］将蔗糖酯作为辅助脂质加入到脂质体中制备成阳离子脂质体用于基因递送。实验发现，通过改变蔗糖头组的大小和长度和烷基链的数量，可加速药物的释放速度，促进分散，防止沉淀，增强稳定性。

8 结语与展望

阳离子脂质体作为载体是将外源基因引入到宿主细胞最早的方法之一。对阳离子脂质体研究的大部分工作都集中在对阳离子头基的研究，早期主要是以铵基作为单价阳离子头基，后来发现多氨基亲水性头部转染效率更高。近几年的研究大多以氨基酸类和咪唑基等环状化合物对阳离子脂质体的头部进行修饰（图1），通过增加阳离子基团数进而增强其与DNA的结合能力，提高转染效率。阳离子脂质体的疏水尾部一般为脂肪链烷烃。研究发现，脂肪链越短，转染效率越高，也有阳离子脂质体以胆固醇衍生物和酒石酸作为尾部，可增强其稳定性。而连接键一般为酰胺键、胺甲酰键和氨基甲酸酯键，酯键和醚键，连接键的选择主要考虑能提高脂质体的稳定性和可降解性。阳离子脂质体通常由类脂和助类脂组成，中性辅助酯最常用的是二油酰磷脂酰乙醇胺，并能直接诱导脂质体膜与内涵体膜融合，从而释放DNA，提高转染效率和降低细胞毒性。除了对头部，尾部和连接键进行适当的修饰，也有很多通过酒石酸、通明质酸和叶酸等天然物质对阳离子的表面进行修饰来获得高效，安全的阳离子脂质体。综上所述，设计合成一个新的阳离子脂质体应从阳离子脂质体头部，连接键，尾部和表面修饰等方面着手，通过凝胶阻滞实验、细胞毒性实验和转染实验等确定所设计合成的脂质体是否符合作为非病毒基因载体的要求。

近年来，非病毒基因载体的发展迅速，阳离子脂质体是介导基因转染的非病毒基因载体中的一大研究热点。无数研究者，针对其转染效率、细胞毒性、安全性、靶向性和容量等方面对阳离子脂质体进行修饰，而用于修饰阳离子脂质体的物质大多为一些天然存在的或人体生长发育所需的物质，如多糖、氨基酸、多肽和通明质酸等，它们对阳离子脂质体的修饰，增加了其转染效率和降低了其细胞毒性，所以使阳离子脂质体在发挥其基因传递作用的同时更加安全。

图1 阳离子脂质体构建思路.

阳离子脂质体虽作为非病毒基因载体的研究已很多，但仍有很多方面需要深入研究，如阳离子脂质体的稳定性、抗氧化性和肿瘤靶向性等，通过对其结构修饰和作用机制等方面进行深入研究，设计和合成更多安全高效的非病毒基因载体，促进阳离子脂质体的临床研究，为介导肿瘤治疗的阳离子脂质体的研究提供更多思路，为非病毒基因载体的研究奠定更坚实的基础。