雷公藤多苷对雄性SD大鼠生殖系统损伤的动态变化及其可能机制

郭健敏，黄远铿，雷夏凌，韩 重，梁 纯，杨 威

（1.广东省生物资源应用研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东广州 510260；2.广东莱恩医药研究院有限公司，广东广州 510990；3.香港科技大学，香港 999077）

雷公藤多苷（multi-glycosides from Tripterygium wilfordii Hook.f.，GTW）亦称雷公藤总苷，GTW片是目前应用最广泛的口服雷公藤制剂之一［1］，主要用于治疗风湿性和类风湿性关节炎、肾小球肾炎、肾病综合征、红斑狼疮和自身免疫性肝炎等免疫性疾病，疗效显著［2-3］，但不良反应也十分明显。临床服用GTW常见的不良反应主要有恶心、食欲减退、谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高、白细胞及血小板减少、月经紊乱及精子减少等［4-6］。其中，在生殖系统方面的毒性十分突出，对男性生殖系统影响尤为明显，可引起精子数量减少、活动力下降、畸形率增加、睾丸萎缩和性欲减退等症状。目前，对GTW雄性生殖毒性的研究主要集中在睾丸的生精功能、组织标志酶、对精原细胞的杀伤与诱变等方面，但未见其对生殖系统毒性动态过程的研究。为此，本研究选择处于性器官发育阶段的雄性SD大鼠，通过精子检查、生殖脏器系数和组织病理等指标，动态观察GTW生殖毒性的发展过程及可逆性，同时针对下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamus-pituitarygonadal axis，HPG轴）激素分泌和激素受体表达探讨其毒性机制，为临床合理用药以及配伍减毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、主要试剂和仪器

5周龄雄性SD大鼠180只，体质量110～150 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2011-0006，饲养温度21～25℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，级压差＞10 Pa；GTW片，江苏美通制药有限公司生产，多苷含量为每片10 mg，包装规格为每瓶100片，批号101224；异氟烷，深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号204110201；促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和睾酮（testosterone，T）测定试剂盒，均购自大连泛邦化工技术开发有限公司（R&D公司分装）；雄激素受体（androgen receptor，AR）免疫组化试剂盒，购自美国Santa cruz公司。3-18K高速冷冻离心机，德国Sigma公司；ASP 300全密封自动脱水机、EG1160石蜡包埋机和RM2235轮转式切片机，德国Leica公司；Olympus BX 41生物荧光显微镜和DP71图像采集头，日本Olympus公司；IPP 6.0病理图像分析软件，美国Mediacybernetics公司；ELx800型酶标仪，美国BioTek公司。

1.2 动物分组、给药和动态观察

大鼠适应性观察7 d后，根据体质量随机均衡分组。本实验室前期急性毒性预实验结果显示，GTW小鼠半数致死量（LD50）为185.3 mg·kg-1，据此将大鼠分为正常对照组、GTW 37.8和94.5 mg·kg-1组（按公斤体质量折算约为临床剂量24和60倍，按体表面积折算为4和10倍），每组60只，各组ig给药，正常对照组给予等体积纯水，给药容积10 mL·kg-1，每天1次，连续90 d。每组于开始给药后第7天（d7），d15，d30，d60，d90和d120（恢复30 d）检测相关指标。

1.3 伊红染色观察精子形态

大鼠安乐死后，取出单侧附睾尾剔除脂肪，剪断球状部位后，将断面涂于滴有生理盐水的洁净载玻片，干燥后伊红染1 min，95%乙醇漂洗，干燥后封片镜检。每只大鼠400倍下采图5张，随机计数并观察200个精子，计算未成熟精子率（immature sperm rate，ISR）和畸形精子率（abnormal sperm rate，ASR）［7-8］。ISR（%）=未成熟精子数/精子总数×100%。ASR（%）=畸形精子数/精子总数×100%。

1.4 脏器系数

大鼠禁食16～20 h，麻醉后腹主动脉取血安乐死，取出脑、垂体、睾丸和附睾，剔除脂肪后称重，计算脏器系数。脏体系数=脏器质量（g）/体质量（g）×100。脏脑系数=脏器质量（g）/脑质量（g）。

1.5 HE染色检查组织病理变化

脏器用4%甲醛固定后，常规脱水、包埋，切片4 μm，HE染色，镜下观察睾丸和附睾组织病理变化。病理变化使用半定量方式进行统计，分级标准见表1。

1.6 ELISA法检测生殖激素水平

大鼠麻醉后腹主动脉取血，2000×g离心15 min取血清，双夹心ELISA试剂盒检测d60血清GnRH，LH，FSH和T激素水平［9］，具体步骤参见试剂盒说明书。

1.7 免疫组化法检测HPG轴和脏器组织中AR表达水平

SABC免疫组化法检测正常对照组和GTW 94.5 mg·kg-1组d60，d90和d120（恢复30 d）大鼠下丘脑、垂体、睾丸和附睾AR表达水平，具体步骤参见试剂盒说明书。阳性颗粒或阳性区域呈棕黄色［10］。结果采用IPP6.0软件进行分析，计算阳性颗粒或阳性区域的积分吸光度（integrated absor⁃bance，IA），判断阳性反应的强度。

Tab.1 Grading standard of pathological changes in testis and epididymis tissues（HE staining）

1.8 统计学分析

实验结果数据以x±s表示，采用SPSS 17.0软件分析组间差异，检验方差齐时采用t检验，方差不齐时采用t′检验。以P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GTW对雄性大鼠精子形态的影响

与正常对照组相比，GTW 37.8和94.5 mg·kg-1组d60，d90和d120（恢复30 d）ISR显著升高（P＜0.01）；d30，d60和 d90 ASR 明显升高（P＜0.05，0.01）。大鼠开始给药时约为5周龄，未达到性成熟，d30后正常对照组雄性大鼠ISR＜5%，ASR＜30%，精子发育良好；GTW 37.8和94.5 mg·kg-1组d30后ISR持续升高，表现出精子发育障碍（表2）。主要畸形有断头、圆头、折叠和头部不定型4种。

2.3 GTW对大鼠生殖脏器系数的影响

与正常对照组相比，GTW 37.8 mg·kg-1组自d60、GTW 94.5 mg·kg-1组自 d15起，睾丸和附睾脏器质量、脏体系数和脏脑系数明显下降（P＜0.05，P＜0.01），d120（恢复30 d）未见改善（P＜0.01）。表明GTW长期给药可使睾丸和附睾萎缩及脏器减轻，恢复30 d后未恢复（图1）。

2.4 GTW对大鼠睾丸和附睾组织病理变化的影响

Fig.1 Effect of GTW on reproductive organ mass（A），organ-body coefficient（B）and organ-brain coeffi⁃cient（C）of male SD rats.See Tab.2 for the rat treatment.1：testis；2：epididymis.Organ-body coefficient=organ mass（g）/body mass（g）×100.Organ-brain coefficient=organ mass（g）/brain mass（g）.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

GTW 94.5 mg·kg-1组大鼠自d7起，即出现睾丸曲细精管内各级生精细胞数量明显减少甚至消失，管腔缩小、管壁变薄，形态不规则，部分曲细精管内可见多核巨细胞；随给药时间的延长，病变越明显，病变严重者可见睾丸内所有曲细精管均萎缩，曲细精管内各级生精细胞消失，睾丸体积明显缩小。上述病变在d120（恢复30 d）未见明显恢复（图2和表3）。

Tab.2 Effect of multi-glycosides from Tripterygium wilfordii Hook.f.（GTW）on immature sperm rate（ISR）and abnormal sperm rate（ASR）in male SD rats

GTW 94.5 mg·kg-1组d7时，附睾管内精子未成熟现象，与正常对照组比较无明显差异；d15和d30时附睾管内精子发育障碍，出现短小、断头或断尾或形态异常精子；d60和d90多出现附睾管内空虚，管腔缩小，仅见未成熟精子或细胞成分；d120（恢复30 d）未见恢复（图2和表3）。

2.5 GTW对大鼠生殖激素分泌的影响

与正常对照组相比，d60时 GTW 37.8和94.5 mg·kg-1组血清FSH，LH和T水平明显降低（P＜0.01），GnRH分泌未见异常（表4）。

Fig.2 Effect of GTW 94.5 mg·kg-1on pathological changes of testis and epididymis in male rats（HE staining，×100）.See Tab.2 for the rat treatment.↑（in testis tissue）：seminiferous tubular atrophy and/or sperm production disorders；↑（in epididymis tissue）：emptiness of epididymal lumine and/or no mature sperm.

Tab.3 Effect of GTW on pathological changes of testis and epididymis in male rats

2.6 GTW对大鼠雄激素受体表达水平的影响

免疫组化结果显示（图3，表5），d60和d90时GTW 94.5 mg·kg-1组下丘脑中AR表达水平低于正常对照组（P＜0.05，P＜0.01），d120（恢复30 d）恢复。睾丸和附睾中AR表达水平在给d60，d90和d120均低于正常对照组（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of GTW on reproductive hormone levels of male SD rats

Fig.3 Effect of GTW 94.5 mg·kg-1on androgen receptor（AR）expression in SD male rats（Immunohistochemical staining，×400）.See Tab.2 for the rat treatment.Positive particles or positive areas are brownish yellow.↑：positive reaction particle.

Tab.5 Effect of GTW on AR expression in male rats

3 讨论

生殖系统功能在机体内各种因素共同调控下运行，药物对生殖系统造成的损伤可能是通过多种途径，例如直接损伤生殖器官、组织或细胞［9］，或通过影响各种酶类，生殖激素和细胞因子等间接损伤生殖系统。临床上GTW对生殖系统的不良反应多发，对于男性患者，短期服用可造成精子活力下降，畸形精子增多；服用2个月后，精液几乎无可见精子［11-12］。青少年应用雷公藤制剂对第二性征发育及性激素水平无明显影响，但可影响部分患儿青春期的生精过程［13］。目前大部分研究已证实，GTW的毒性与用药剂量和时程有关，但是对雷公藤所致的生殖系统功能损伤的发生时点、具体损伤的部位和程度是否可逆等，由于临床研究的局限性，尚缺乏系统的研究［14］。本研究选用的雄性大鼠在给药开始时为5周龄、出生后35 d（postnatal 35 day，PND 35），性器官发育处于关键阶段，给药期大鼠从5周龄（PND 35）至18周龄（PND 125）基本覆盖了青春期至青壮年时期，同时根据临床用药特点设计了给药后d7，d15，d30，d60和d90为观察时间点，以对应临床短期用药和长期用药的情况，用于动态观察GTW对雄性大鼠生殖系统的影响。本研究结果显示，GTW在d7起即对雄性大鼠生殖器官造成损伤，造成精子形成障碍，畸变精子增多，病变发生起始时间有剂量相关性。值得关注的是，经过90 d长期给药后恢复30 d，ASR趋于正常，ISR继续升高，睾丸和附睾的病变未见改善。雄性SD大鼠精子发育成熟约12 d，精子发生整个时程约48 d，可见GTW的毒性可能作用于精子发生的整个过程［15］，并随着给药时间延长损伤进行性加重。据临床报道，男性服药1～2个月后停药一段时间生殖功能可恢复，但缺乏长期用药的临床报道［16］。本研究结果提示，有生育需求的男性在长期应用GTW时需要慎重权衡。

为了探讨GTW生殖毒性机制，考察GTW是否影响HPG轴，且由于d30后大鼠才达到性成熟，因此选择在d60检测性激素。结果显示，d60大鼠激素水平已经很低，因此选择GTW 94.5 mg·kg-1组继续检测AR表达，进一步观察GTW对生殖系统的损伤是否与HPG轴有关，期望为临床上患者应用GTW出现明显生殖系统毒性时的防治提供思路。本研究结果表明，GTW组雄性大鼠血清FSH，LH和T水平降低，但GnRH分泌正常。LH降低使睾丸间充质细胞得不到足够的刺激，造成T分泌减少（T降低负反馈调节减弱，因此GnRH分泌正常），影响精子形成的过程。FSH的降低阻碍了精子发生的启动，影响到精子生成的全过程，两者相互作用。HPG轴是一个既有层次又相互作用的系统内分泌架构，形成调控性激素分泌稳态的调节环路，调节生殖器官的成熟发育和生殖的全过程［17］，提示GTW可通过抑制激素分泌影响精子生成，导致精子生成障碍并且随着给药时间延长进行性加重。本研究结果还表明，GTW能显著下调雄性大鼠下丘脑、睾丸和附睾中AR表达。AR是介导雄激素发挥作用的必须物质，雄性大鼠AR的基因突变或缺失会造成生殖器官发育畸形甚至不育［18-19］，提示GTW可能会引起生殖器官发育损伤。经过本研究动态观察，GTW给药后精子发育、睾丸和附睾脏器损伤进行性加重，提示GTW对生殖系统的毒性机制与下调AR表达有关。