T2-mapping功能成像在兔膝关节内出血模型中显示出血后关节软骨异常的价值

张玉霞，张璐，王鹏铭，赵飞，赵跃武，葛英辉*

1.郑州大学人民医院 河南省人民医院影像科，河南郑州 450003；2.新乡医学院第一附属医院放射科，河南卫辉 453100；3.郑州大学人民医院 河南省人民医院骨科，河南郑州 450003；4.郑州大学人民医院 河南省人民医院病理科，河南郑州 450003；

由于反复关节出血导致的血友病性骨关节病（hemophilic arthropathy，HA）是血友病患者常见的并发症，具有很高的致畸率和致残率，严重影响了患者的生活质量。血友病目前的治疗措施主要是凝血因子替代治疗，治疗费用高昂，而且也不能阻止慢性骨关节病的发展。如何进一步了解HA的发病机制，认识关节软骨和滑膜病变等的早期可逆阶段的变化，并早期进行干预治疗是有效预防HA的关键。本课题组拟通过建立新西兰大白兔关节内出血模型，模拟HA患者早期关节内出血的状态，采用3.0T MR T2弛豫时间图（T2-mapping）功能成像揭示形态学变化前、软骨早期损伤的影像及病理表现，以期为临床早期预防、干预和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

本实验经河南省人民医院动物实验中心医学伦理委员会允许，服从动物保护的伦理道德要求，批准文号：（2017）伦审第（49）号。

1.1 预实验 通过预实验时对软骨厚度的测量，选取8月龄雄性新西兰大白兔作为模型兔，合格证号为SCXK（豫）2013-0001，以股骨正中矢状面的髌股关节面作为主要观察对象（软骨厚约1.4 mm）。

1.2 HA模型兔的建立及实验步骤 选取8月龄新西兰雄性大白兔15只，体重3.0～4.0 kg，购于河南省实验动物中心。造模过程中2只因不耐受麻醉药死亡，1只兔死于关节感染，12只兔顺利完成实验，建模成功。以兔右腿为模型侧，左腿为空白对照。用 3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉（30 mg/kg），从耳缘采自体静脉血2.5 ml，注入关节腔。关节肿胀、关节腔内见暗红色积血，提示造模成功（图1）。因血友病患者关节出血后不完全制动，故兔在饲养过程中尽量不让静卧。在第1周和第2周末各重复注血1次，剂量同前。采用随机数字表法将12只兔随机分为两组，每组6只，分别于第4周、第8周行MRI扫描，动态监测双膝关节软骨变化，并于 MRI检查后立即处死动物取材行病理检查，行HE常规染色观察软骨改变。

图1 以兔右腿为模型侧，左腿为空白对照。从耳缘采自体静脉血2.5 ml，注入关节腔，关节肿胀、关节腔内见暗红色积血，显示造模成功

1.3 MRI检查 采用GE Discovery 7503.0T MR扫描仪，8通道膝关节专用线圈。3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉（30 mg/kg）。模拟人膝关节MRI扫描，足先进，定位线位于兔髌骨下方切线。筛选出适合显示兔膝关节早期软骨改变的序列，分别为：①附加脂肪抑制的三维快速扰相梯度回波（3D-FS-SPGR）序列：TR 21.51 ms，TE 7.56 ms，层厚1.2 mm，无间距扫描，矩阵192×160，视野8 cm×8 cm，激励次数2次；②T2-mapping：TR 1000.00 ms，TE 6.81、13.62、20.42、27.23、34.04、40.85、47.66、54.46 ms，层厚2.0 mm，层间距0.4 mm，矩阵192×128，视野8 cm×8 cm，激励次数4次。

1.4 MRI图像后处理及分析 将图像输入GE ADW 4.5图像后处理工作站，得到股骨正中矢状面的髌股关节面软骨厚度、T2-mapping伪彩图和T2值。感兴趣区（ROI）测量：找到股骨正中矢状面的髌股关节面连接前后缘的股骨骺线，然后以这条线的中点为中心，分别向与该线成1/4π、1/2π、3/4π的角度作直线，与软骨的3个交点即为ROI选取点。每个ROI包含从骨皮质到关节表面的软骨区域，面积均为1 mm2（图2）。

图2 在T2-mapping上找到股骨正中矢状面的髌股关节面连接前后缘的股骨骺线，然后以这条线的中点为中心，分别向与该线成1/4π、1/2π、3/4π的角度作直线，与软骨的3个交点即为ROI选取点

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，Kolmogorov-Smirnov检验计量资料是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料以±s表示。采用配对样本t检验分别比较第4周的模型侧和对照侧间、第8周的模型侧和对照侧间及第 4周与第 8周模型侧间的 T2值，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRI表现 ①第4周和第8周模型侧与对照侧相比，3D-FS-SPGR序列所示软骨未见明显异常，滑膜无明显增厚。②第4周，模型侧T2-mapping伪彩图未见明显异常；第8周，模型侧T2-mapping伪彩图见股骨远端软骨正常的蓝绿色阶因软骨损伤而出现红黄色色阶（图3）。③第4周和第8周，模型侧软骨T2值均高于对照侧，差异有统计学意义；模型侧第8周T2值较第4周升高，但差异无统计学意义，见表1。

表1 关节内出血模型侧与对照侧兔建模后不同时间行T2-mapping检查的T2值比较（ ±s）

表1 关节内出血模型侧与对照侧兔建模后不同时间行T2-mapping检查的T2值比较（ ±s）

t值-2.509-4.332 P值0.0290.001

图3 第8周，对照侧脂肪抑制三维快速扰相梯度回波（3D-FS-SPGR）序列（A）和T2-mapping（B）像和模型侧3D-FS-SPGR序列（C）和T2-mapping（D）像比较。A和C图相比，软骨形态差异不明显，C中软骨区域黑色信号，为关节腔内的积血存留；B图示正常股骨远端软骨呈蓝绿色阶，D图因软骨损伤而出现红黄色阶。对照侧和模型侧因关节腔积血伸展受限，软骨显影位置稍有偏差

2.2 病理表现 对照侧关节软骨表面光滑，软骨呈瓷白色，有光泽，均匀一致。显微镜下软骨细胞分布均匀，细胞核、软骨陷窝清晰可见（图4A）。模型侧第4周和第8周，关节软骨表面均光滑，软骨呈淡红色，滑膜未见增厚。第8周关节腔内可见少量浓稠暗红色积血，股骨外侧髁软骨表面局部不光滑，无溃疡形成。显微镜下软骨细胞排列紊乱，数目减少，软骨陷窝增多，软骨细胞核显影模糊，细胞的分裂象增多（图4B）。

图4 关节内出血模型侧与对照侧兔病理表现。显微镜下对照侧软骨细胞分布均匀，软骨陷窝清晰（HE，×200，A）；模型侧软骨细胞排列稍紊乱，软骨细胞稍减少，细胞核显影模糊（HE，×200，B）

3 讨论

HA的发病机制目前尚不清楚，反复的关节内出血是滑膜和软骨改变的始动因素。血液及其代谢产物可以直接损伤软骨细胞[1]，多种血液成分可以触发关节病进程[2]。Tan等[3]的研究结果表明，一次性的关节内出血模型，在第3周会产生明显的病理变化，但如果没有反复的出血过程，在第1次出血后的第6周病变关节开始恢复正常，说明1次出血造成的软骨和滑膜损伤有自愈机制，造成的损伤是可逆的。因此，HA的模型需要建立在关节腔多次出血的基础上，这样也更贴近血友病患者反复关节出血的真实临床情况。本研究应用多次膝关节腔内自体静脉血注入来模拟HA患者靶关节反复出血的状态。在这个模型中，出血量和出血时间均可以得到很好的控制，从而提供相对准确、可量化的指标和数据。兔膝关节解剖结构与人相似，软骨的退变情况也与人接近，所以本实验中选用兔作为模型实验对象。

3D-FS-SPGR序列在高场强成像中，因其高信噪比、高分辨率的薄层压脂技术及其对软骨层状结构的显示有助于诊断软骨病变。T2-mapping是通过计算T2WI图像中每个体素在不同回波时间下的 T2弛豫时间，利用图像后处理软件生成T2伪彩图，即软骨T2值的空间分布图[4]。T2-mapping成像反映了软骨内水分子之间及水分子和周围大分子之间的相互作用，可以根据水含量T2值的变化反映软骨基质内各种成分的变化，进而反映软骨的生理生化等信息[5]。软骨内水分子与周围组织大分子（如胶原蛋白）之间的相互作用可以限制水分子的运动能力，病变软骨胶原蛋白减少，水分子运动能力增加，导致含水量增加，从而引起T2值升高[6]。近年有学者针对HA的影像表现进行研究[7]，但是HA患者的T2-mapping成像表现仅有个案报道[8-9]。

软骨损伤后，软骨基质及胶原纤维网排列改变，胶原蛋白网络破坏导致蛋白聚糖流失，引起病变区含水量及水分子活动能力增加，病变软骨区域T2值升高，是早期软骨损伤的重要征象。本实验中，第4周和第8周，模型侧关节软骨T2值明显高于对照侧，此时形态学未见明显变化，验证了T2弛豫时间延长是关节软骨损伤最早出现的征象，发生在软骨变性的最初阶段，与Liebl等[10]的研究结果一致。在软骨病变早期，软骨内含水量与软骨内结构破坏严重程度呈正相关，水含量越多，T2值越高，预示软骨内组织结构破坏越严重。Wei等[11]通过对膝关节软骨标本的组织学分析发现，T2值随退变程度的增加而增高，且与水含量呈正相关，与糖胺聚糖含量呈负相关。模型侧的T2值从第4周到第8周逐渐升高，但差异无统计学意义，这可能是HA发展过程中，首先发生软骨肿胀以及含水量增加，同时伴有胶原纤维各向异性的变化，然后软骨表面构架崩解，使得胶原含量下降，同时伴随水分丢失，即伴随着HA的发展，软骨内的成分以及结构异质性亦不断增加，所以T2值在整体上呈上升趋势，但第8周的T2值与第4周比较，升高并不明显。T2-mapping成像通过后处理产生不同的色阶，反映了软骨内水分子的不同弛豫时间，因此在第8周破坏区软骨色阶上亦有相应变化，而第4周色阶变化不明显可能与人的肉眼分辨率有关。

在软骨出现轻微病理学改变时，滑膜增厚不明显，与Hooiveld等[12]的“关节内出血可直接对软骨造成损害”这一观点一致，但该论点在国内外存在争议，仍需要大样本量研究支持。本研究的局限性在于，因前期实验时间和标本量有限，未能对标本第8周以后的变化进行动态跟踪，在今后的研究中会继续进行更深入的探讨。

总之，T2-mapping伪彩图及其T2值早于3D-FSSPGR发生变化，T2-mapping作为一种功能MRI可以反映HA模型兔膝关节软骨形态学变化之前的软骨生化代谢变化。