携白细胞介素-8单克隆抗体的靶向对比剂对兔心肌梗死微循环的定量研究

张晓奇，张容亮，孙月，陆永萍

昆明医科大学第四附属医院，云南省第二人民医院超声科，云南昆明 650021；

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后对心肌微循环的评估可预测患者预后，心肌声学造影（myocardial contrast echocardiography，MCE）采用的对比剂微泡与红细胞有相似的流变能力，可用于评估心肌微血管灌注的程度[1]。炎症反应参与心肌梗死的整个过程。AMI后，心肌缺血及坏死部位会释放多种炎性细胞因子，白细胞介素（interleukin，IL）是参与其中的重要细胞因子之一[2]，其中 IL-8具有促进炎症反应、刺激血管生成等作用[3]。本研究采用SonoVue对比剂耦联IL-8单抗后形成靶向对比剂，对心肌梗死兔模型行 MCE检查，对比单纯使用SonoVue对比剂，对兔心肌梗死后心肌微循环灌注进行定量分析，评价携 IL-8单抗对比剂的特异性靶向功能，使MCG能够更准确、更早期地诊断缺血性心脏病，为定量分析、评估心肌灌注提供一种无创且更加精准的方法。

1 材料与方法

1.1 制备动物模型 选取健康成年日本大耳白兔30只[由昆明医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证SCXK（滇）2011-0004]，体重2.7～3.5 kg，雌雄不限，体健毛光。采用简单随机抽样法，将30只兔排号，通过抽签的方式随机分为AMI组和假手术组，每组15只。AMI组：结扎冠状动脉左前降支制作左心室前壁、前间隔心肌梗死模型；假手术组：同一结扎点只穿线不结扎，其他操作均与AMI组相同。具体操作见既往研究[4]。

1.2 制备携IL-8单抗的靶向对比剂 采用共价耦联法通过SPDP交联剂将IL-8单抗耦联于SonoVue微泡表面，制备靶向超声对比剂[5]。

1.3 对动物模型行常规心脏超声检查及 MCE检查采用Philips iE33型超声诊断仪，心脏探头型号S5-1，频率为1.8/3.6 MHz。将各组兔分别于术前、术后30 min、2 h及6 h行常规心脏超声检查、SonoVue对比剂及携IL-8单克隆抗体靶向对比剂MCE检查。各组兔每次完成常规心脏超声检查后，启动造影程序，每次抽取0.15 ml SonoVue对比剂，经兔耳缘静脉团注，然后立即使用1 ml生理盐水冲注，重点观察造影时左心室短轴乳头肌水平各节段心肌的超声图像变化，记录开始显影时间，待心肌显影稳定后，通过触发高能量脉冲（Flash闪烁）对心肌组织内的对比剂进行破泡，观察仪器自动转换成低能量实时造影过程中对比剂再充盈情况，储存检查过程中的全部动静态图像，应用QLAB 8.0软件，在左心室乳头肌水平短轴切面上选取前间隔、前壁、下壁和后间隔 4个节段作为主要分析节段（因对比剂微泡进入左心腔后，侧壁及后壁受到声衰减影响，故而不列入研究节段），对充盈影像进行脱机分析，分析过程中，所有的实验动物命名只用编号，不标明分组。设定感兴趣区域后，以Flash后第一帧为起点，绘制感兴趣区域心肌对比剂灌注的时间-强度曲线（time-intensity curve，TIC）。软件可计算出感兴趣区域的超声均值、超声峰值、达峰时间、超声中值等，本实验选取超声均值、达峰时间、开始显影时间作为研究指标。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件，正态分布的计量资料以±s表示。同一样本进行2次不同处理，用配对t检验；2个不同样本进行相同处理，用独立样本t检验。多个样本比较采用方差分析。等级资料用秩和检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制备情况 30只模型兔在实验过程中，假手术组死亡2只，其中1只在开胸后立即死亡，原因可能是麻醉过量引起呼吸衰竭、死亡；另1只术中因胸膜破裂致呼吸衰竭死亡；AMI组死亡5只，其中2只为术中胸膜破裂致呼吸衰竭死亡，另外3只分别于结扎冠状动脉后约15 min、1 h及3 h后死亡，可能与手术操作不当、麻醉不当、心肌梗死面积过大、动物模型本身等因素有关。

2.2 QLAB定量分析 以开始注射对比剂为起点，2种对比剂 AMI组各节段心肌对比剂视频强度的超声均值见表1。

表1 AMI组各节段心肌对比剂视频强度的超声均值比较（ ±s，dB）

表1 AMI组各节段心肌对比剂视频强度的超声均值比较（ ±s，dB）

注：与术前比较，*P<0.05；与下壁比较，#P<0.05；与后间隔比较，&P<0.05

术后 2 h（n=11） SonoVue 4.91±0.95*# 4.96±1.05*& 14.87±1.44 15.02±1.87 IL-8靶向8.78±1.30*#8.99±0.99*&18.26±2.37*18.49±2.31*术后6 h（n=10）SonoVue 5.09±1.25*#5.20±1.11*&15.46±1.7815.03±1.83 IL-8靶向9.52±1.13*#9.32±1.39*&18.45±2.23*18.65±2.14*

各节段心肌超声均值比较：术后30 min、2 h及6 h，AMI组两造模节段（前壁及前间隔）的对比剂超声均值低于术前，差异有统计学意义（P<0.05）；前壁与下壁之间比较，术后30 min、2 h及6 h，前壁的对比剂超声均值低于下壁，差异有统计学意义（P<0.05）；前间隔与后间隔之间比较，术后30 min、2 h及6 h，前间隔的对比剂超声均值低于后间隔，差异有统计学意义（P<0.05）。

对比SonoVue对比剂及携IL-8单抗靶向对比剂：术前两者前壁、前间隔、后间隔、下壁的对比剂超声均值比较，差异无统计学意义（P>0.05）；而术后30 min、2 h及6 h，携IL-8单抗靶向对比剂两造模节段（前壁及前间隔）的对比剂超声均值均高于SonoVue对比剂，差异有统计学意义（P<0.05）。同时，在术后30 min、2 h及6 h，后间隔、下壁的携IL-8单抗靶向对比剂超声均值高于术前，差异有统计学意义（P<0.05），而SonoVue对比剂术前、术后超声均值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

以开始注射对比剂为起点，假手术组2种对比剂前壁和前间隔心肌对比剂视频强度的超声均值见表2。术后30 min、2 h及6 h，AMI组前壁及前间隔的对比剂超声均值均低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 假手术组兔造模节段心肌对比剂视频强度的超声均值比较（ ±s，dB）

表2 假手术组兔造模节段心肌对比剂视频强度的超声均值比较（ ±s，dB）

节段对比剂术前术后30 min 术后2 h 术后6 h前壁SonoVue 14.54±1.6814.54±1.7014.66±1.9014.49±1.61 IL-8靶向15.08±1.7814.61±1.5214.34±1.7614.48±2.04前间隔SonoVue 15.02±1.5914.64±1.9414.47±2.0514.57±1.98 IL-8靶向14.93±1.9014.43±1.9914.97±1.9414.47±1.68

2.3 AMI组造模节段2种对比剂达峰时间和开始显影时间比较 以Flash第一帧为起点，对AMI组造模节段对比剂达峰时间比较，术后30 min、2 h及6 h，IL-8单抗靶向对比剂AMI组2个造模节段（前壁及前间隔）的靶向对比剂达峰时间早于 SonoVue对比剂，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 2种对比剂、AMI组造模节段对比剂的达峰时间比较（±s，s）

表3 2种对比剂、AMI组造模节段对比剂的达峰时间比较（±s，s）

注：与SonoVue对比剂比较，*P<0.05

对比剂节段对比剂达峰时间术前术后30 min 术后2 h 术后6 h SonoVue 前壁0.62±0.100.96±0.110.95±0.080.93±0.10前间隔 0.63±0.11 0.94±0.10 0.95±0.09 0.92±0.09 IL-8靶向前壁0.67±0.100.44±0.09*0.45±0.10*0.45±0.09*前间隔0.68±0.100.45±0.10*0.45±0.09*0.46±0.09*

以开始注射对比剂为起点，对AMI组造模节段心肌开始显影时间比较，术后30 min、2 h及6 h，AMI组2个造模节段（前壁及前间隔）的携IL-8单抗靶向对比剂开始显影时间明显早于 SonoVue对比剂，差异有统计学意义（P<0.05），见表4及图1～4。

表4 2种对比剂、AMI组造模节段对比剂开始显影时间比较（±s，s）

表4 2种对比剂、AMI组造模节段对比剂开始显影时间比较（±s，s）

注：与SonoVue对比剂比较，*P<0.05

对比剂节段对比剂开始显影时间术前术后30 min 术后2 h 术后6 h SonoVue 前壁12.65±0.5215.87±0.7915.37±0.7215.01±0.52前间隔 12.66±0.67 16.10±0.75 15.39±0.80 15.21±0.56 IL-8靶向前壁16.89±0.9711.03±0.67*11.31±0.70*11.56±0.65*前间隔16.79±0.9911.07±0.78*11.19±0.72*11.61±0.67*

图1 携IL-8单抗靶向对比剂假手术组和AMI组心肌各节段对比剂充盈的时间-强度曲线（TIC）。假手术组前壁、前间隔、后间隔及下壁4个不同节段的曲线走行及水平相近，AMI组前壁、前间隔2个节段的曲线水平明显低于后间隔和下壁

图2 SonoVue对比剂：假手术组术后30 min心肌显影过程

图3 SonoVue对比剂：AMI组术后30 min心肌显影过程

图4 术后30 min假手术组、AMI组携IL-8单抗靶向对比剂（A为假手术组，B为AMI组）及SonoVue对比剂（C为假手术组，D为AMI组）充盈初期，AMI组携IL-8单抗靶向对比剂即可见对比剂充盈，其余未见明显对比剂充盈

3 讨论

近年来，超声靶向微泡造影技术逐渐成熟，已成为国内外超声诊断、治疗研究的热点。既往MCE检查中，SonoVue是较为常用的对比剂，而在AMI过程中常伴随组织坏死和炎症细胞浸润。IL-8是一种具有强血管生成特性的炎性趋化因子[6]，在心肌梗死缺血坏死部位高表达，通过在普通超声微泡表面装配具有炎症靶向性的特异配体（IL-8单抗），可构建成能与急性心肌梗死炎症细胞浸润区域靶向结合的靶向性超声微泡，对该区域有更好的显像效果。

心肌微循环灌注在AMI期间有非常重要的意义。普通的冠状动脉造影往往针对的是冠状动脉形态学检查，仅限于直径＞100 μm的冠状动脉，而MCE能够有效显示直径＜100 μm的微血管，可评估心肌血流灌注情况[7]。本实验使用SonoVue对比剂及携IL-8单抗的靶向对比剂行MCE时，对于同一实验兔，AMI组2个造模节段（前壁及前间隔）的对比剂超声均值均低于术前、非梗死区、假手术组，证实MCE定量评价心肌梗死区域的可靠性。AMI组在术后30 min、2 h及6 h，后间隔、下壁的携IL-8单抗靶向对比剂超声均值高于术前（P<0.05），而SonoVue对比剂则没有这种现象。这是由于 AMI激活心肌内皮细胞和白细胞炎症反应，可能会导致全身性的炎症变化[8]，后间隔及下壁同样会有的炎性因子浸润，因此会表现出显影较术前更明显的现象，是携 IL-8单抗靶向对比剂与炎性因子IL-8之间存在靶向性的又一证明。

同时，AMI组2个造模节段（前壁及前间隔）的携IL-8单抗靶向对比剂超声均值均高于SonoVue对比剂，且携IL-8单抗对比剂的显影时间和达峰时间均早于SonoVue对比剂，反映了IL-8单克隆抗体与缺血心肌释放的炎性因子IL-8之间的靶向性，携IL-8单抗靶向对比剂可以特异地集聚于缺血心肌内，与炎性因子结合、显影，其显影效果和速度优于普通SonoVue对比剂。兔在冠状动脉结扎术后造模节段的微循环会显著减少，而侧支循环的建立需要时间，MCE结果本应表现为充盈较差甚至充盈缺损，但实验过程中，AMI组术后应用携IL-8单抗靶向对比剂30 min即表现出造模节段对比剂充盈明显强于SonoVue对比剂，充盈速度快于SonoVue对比剂。因此，在AMI早期（术后30 min），造模节段的炎性因子IL-8明显升高。因此，心肌缺血可行携带 IL-8单抗的靶向对比剂 MCE检查，其效果优于普通SonoVue对比剂MCE检查，在识别梗死区域方面有较大优势，为诊断缺血性心脏病提供了一种更早期、更精准的方法。

本研究的局限性为：首先，由于所用超声仪器使用了成人心脏超声探头，型号为S5-1，频率过低（频率仅1.8/3.6 MHz），观察兔心脏的分辨率相对较差，图像质量较低，会影响研究图像的精确性；这个可通过将来研究中更换更高频率的心脏超声探头进行改善。其次，本研究由于对比剂微泡进入左心腔后，侧壁及后壁受到声衰减影响，仅能观察前间隔、左心室前壁、下壁、后间隔，无法观察左心室侧壁、后壁。因此观察不够全面，这也是超声二维成像本身的局限性，郑智超等[7]的研究显示，与普通的二维 MCE检查相比，声学造影RT-3DE成像可以更立体、更全面地对各室壁显像，此方法可以在后续研究中加以运用。靶向对比剂携带的 IL-8单抗可与心肌缺血区域的IL-8特异性结合、显影，其对心肌微循环灌注研究具有独特的优势，携IL-8单抗靶向对比剂MCE检查可对缺血性心脏病提供更早、更精确的诊断方法，是目前较为理想的方法。此外，携IL-8单抗靶向对比剂对缺血心肌部位 IL-8的靶向性为今后心肌缺血早期从细胞及分子水平进行诊断、治疗提供了新的思路，随着分子影像学的发展，本课题组也将对超声微泡的靶向治疗进行更深层次的研究。