12种培美曲塞新型衍生物的抗菌活性分析

刘 秀, 贾玉萍，贾庆文，马玉奎，郭中坤,3，王可洲,3*

（1. 济南大学/山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200；2. 山东省药学科学院，山东 济南250101；3. 山东省医学科学院 山东省实验动物中心，山东 济南 250002）

二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）抑制剂能选择性地与DHFR结合，阻止或抑制正常底物与之结合，从而阻碍机体细胞生长和繁殖所必须的物质──叶酸的正常代谢，最终导致肿瘤细胞死亡，从而达到治疗肿瘤的目的[1]。培美曲塞（pemetrexed，PMX）作为常用的DHFR抑制剂之一，主要用于恶性胸膜间皮瘤及非小细胞肺癌的二线治疗[2-3]。有研究显示，某些抗肿瘤药物有可能兼有抗菌作用[4-5]。通常被用作抗肿瘤药的培美曲塞及其衍生物的抗菌活性目前少有报道。本研究选择12种DHFR抑制剂类培美曲塞衍生物，采用优化后的MTT法检测其对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）的半数最低抑菌浓度（half maximal inhibitory concentration，MIC50）及最低杀菌浓度（minimal bactericical concentration，MBC），并以此为指标来评价待测化合物的抗菌活性，筛选出具有抗菌活性的化合物以便进一步研究开发。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

12种培美曲塞衍生物（A1～A12，山东省药学科学院）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），胰酪大豆胨液体培养基（TSB），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，青岛海博生物）；0.9 %氯化钠注射液（辰欣药业）；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT，Biosharp公司）；DMSO（分析纯，国药集团）；青链霉素混合液（100×，Solarbio公司）；培美曲塞二钠（PMX，天津德太然生物医药）。

1.2 仪器

Spx-250B-Z型生化培养箱（上海博迅）；HF safe-1500TE生物安全柜（上海力申）；Spectra Max I3多功能酶标仪（美国MD公司）；JW-1032常温低速离心机（安徽嘉文）。

1.3 试验菌株

大肠杆菌（8099），金黄色葡萄球菌（ATCC6538），白色念珠菌（ATCC10231），由山东省实验动物中心实验室提供。

2 方法

2.1 菌悬液制备

将保存于-80 ℃的甘油冻存菌种采用平板划线法接种于相应培养基平皿中培养（各菌株所用培养基及培养条件[6]见表1）后，挑取生长良好的单菌落于相应液体培养基中培养。

表1 各菌株所用培养基及培养条件

2.2 适于抗菌活性测定的MTT法的建立[7]

2.2.1 最适检测波长及DMSO用量的确定 将菌悬液用0.9 %氯化钠注射液按1:2、1:4比例稀释后，取原液和稀释菌液加入96孔板，每孔100 μl，之后加入20 μl MTT溶液，将菌株置于恒温培养箱（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为37 ℃，白色念珠菌为28℃）中培养60 min后，1000 r/min离心10 min，小心吸去上清，各加入0，100，150 μl DMSO溶解MTT溶液与细菌形成的甲臜结晶，震荡5 min，用酶标仪测定其在400～700 nm范围内每隔50 nm的光密度值（OD），以OD值最大时的检测波长作为最适检测波长。同时设置空白孔及调零孔，各浓度至少3个平行。

2.2.2 最适细菌浓度的确定 取3种菌株处于对数生长期的菌悬液，用适量0.9 %氯化钠注射液稀释至1×109cfu/ml后，再10倍系列稀释8个梯度，测定

2.3 抗菌活性测定

2.3.1 测定MIC50利用建立的MTT法测定抗菌活性，具体步骤如下：将培养好的菌液10倍系列稀释至107cfu/ml左右，取100 μl加至96孔板。称取适量待测化合物（A1～A12）及PMX，配制成200 mmol/L的母液，再用液体培养基梯度稀释，各取100 μl加至相应孔中，使终浓度分别为200，40，8，1.6，0.32 μmol/L，每组设3个复孔，同时设空白对照孔、阳性对照孔[青链霉素混合液（1×）]，96孔板四周孔用液体培养基填充。加药完毕，96孔板置于相应培养温度中培养20 h（真菌44 h）后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h。将96孔板从培养箱中拿出，1000 r/min离心10 min，小心吸去上清，加入DMSO 100 μl，震荡5 min。用酶标仪测定震荡之后的96孔板在500 nm处的光密度值（OD500）。用下式计算待测化合物对细菌/真菌的抑制率（%）：

抑制率（%）=[1-（加药组OD500-调零孔OD500）/（空白对照组OD500-调零孔OD500）]×100 %

2.3.2 MBC测定[9]MIC50测定同时，取未见明显浑浊的孔内培养物10 μl于1.5 ml离心管中，加入新鲜培养基稀释100倍混匀后，吸取100 μl涂布于事先准备好的TSA或SDA平板上培养，未见菌落数生长或平均菌落数小于10个的最小稀释度的药物浓度即为其MBC。

2.4 数据分析

3 结果

3.1 建立适于抗菌活性测定的MTT法

3.1.1 最适检测波长及DMSO用量测定结果 MTT溶液与大肠杆菌形成的甲臜结晶经DMSO溶解后，在450～600 nm范围内有较宽广的吸收峰，且不同浓度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而没有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在650 nm左右；MTT与金黄色葡萄球菌形成的甲臜经DMSO溶解后，在450～550 nm范围内有较宽广的吸收峰，且有明显的特征性吸收峰，不同浓度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而没有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在600 nm左右；MTT与白色念珠菌形成的甲臜经DMSO溶解后，在400～550 nm范围内有较宽广的吸收峰，没有明显的特征性吸收峰。以上结果提示：是否使用DMSO对于实验结果有较大影响；不同用量的DMSO得到的吸收峰特征图较为一致，且各OD值接近，说明使用100 μl的DMSO能将甲臜充分溶解。同时，菌液浓度过高时，得到的OD值较大，线性关系不好且特征性吸收峰不明显，因此，菌液的使用浓度不宜过高。

3.1.2 确定测量范围 不同浓度梯度菌液的OD570均值见表2。由表2可见，大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的菌液浓度为10，102，103，104，105，106cfu/ml时，6组数据两两之间差异均无统计学意义（P＞0.05），但均与107，108cfu/ml组数据差异有统计学意义（P＜0.05）；且107，108cfu/ml 2组数据间差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，当菌液浓度低于106cfu/ml时，对OD570值的影响不显著，因此，在进行MTT检测时，大肠杆菌及金黄色葡萄球菌菌液的检测范围为107～108cfu/ml，白色念珠菌菌液的检测范围则为106～108cfu/ml。

表2 不同浓度梯度菌液的OD570均值

3.2 抗菌活性测定结果

MTT法检测结果表明，12种培美曲塞衍生物对大肠杆菌及白色念球菌均无抑制作用，化合物A4、A7、A11、A12对金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果，MIC50分别为7.05±4.67，1.11±0.2，14.12±0.54，9.86±2.31 μmol/L，并且当这4种化合物的终浓度为200 μmol/L时，对细菌的抑制率分别为97.15 %，98.21 %，97.12 %，97.80 %，均强于青链霉素混合液（1×）对金黄色葡萄球菌的抑制率（96.76 %）。其中，A7的抑制效果最强，且重复性较好。以上结果提示：此类系列药物中某些化合物可能对某些革兰阴性菌及真菌无效，对某些革兰阳性菌有效。结果见表3。

表3 12种培美曲塞衍生物对不同菌种的MIC50及MBC

4 讨论

四甲基偶氮噻唑蓝比色法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。目前，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、抗肿瘤药物的大规模筛选、细胞毒性检测及肿瘤放射敏感性测定等领域[10-14]。药物对细菌的作用检测方面少见报道。本研究发现细菌与MTT形成的甲臜在450～600 nm 处有较宽的吸收峰，在500 nm处有最大吸收峰，该结果与已有的实验结果基本吻合[7,15]。通过对部分条件进行优化，完善了用于抗菌活性测定的MTT法[16-17]，这为之后药物抑菌活性的研究奠定了基础。同时，优化后的MTT法结果表明：部分培美曲塞衍生物具有抗肿瘤作用的同时，兼有抗菌活性[18-19]。此结果提示我们，此类药物发挥抗肿瘤作用的机制是否与其抗菌活性有关、其他类型的DHFR抑制剂是否也具有抗菌活性等药理作用还需要进一步研究，以期发现新的药理活性，为临床合理用药提供可能。