壳聚糖的抗菌、诱抗和促生作用及在农业中应用综述

胡举伟， 刘 辉， 马秀明， 宋 涛

(1.金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沂 276700； 2.养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室，山东临沂 276700；3.农业部植物营养与新型肥料创制重点实验室，山东临沂 276700)

壳聚糖是利用几丁质生产的天然、安全和低成本的生物聚合物，几丁质是节肢动物外骨骼和真菌细胞壁的主要组分，也是仅次于木质纤维素类生物质的第二大可再生碳源[1]。在工业生产中，将固体几丁质浸泡在质量体积比为400～500 mg/mL 的NaOH溶液中，这一过程中可脱去几丁质中80%的乙酰基，从而将N-乙酰-D-葡萄糖胺转变成β-1，4-D-葡萄糖胺。壳聚糖制成品的成分复杂，这是由于壳聚糖脱乙酰的程度、分子量、聚合度、黏性以及解离常数存在差异，壳聚糖这一术语并不是描述1种单一化合物，而是描述1组具有商业应用价值的共聚物。壳聚糖的不均匀性可极大影响其物理特征，并决定其在生物学领域的应用[1]。

壳聚糖的生产成本较低，同时壳聚糖还具有其他良好的生物学特性，例如生物降解性、生物相容性和非致敏性。壳聚糖容易被特异性和非特异性的酶降解，而且对人体呈现出低毒性[2]。壳聚糖所具有的这些特性，使其在多个领域具有很高的应用潜力，如美容、食品、生物技术、药理学和医学[3-4]。

20世纪80年代随着壳聚糖工业批量生产的实现，人们开始试验壳聚糖在农业中应用的可能。众多结果表明，壳聚糖在控制不同作物采前采后病害中具有显著效果。壳聚糖处理可使植物对大量土传和叶面病原物产生更强耐受力，也可诱导植物根结瘤[5]，因此壳聚糖被认为对于农业可持续发展具有应用价值。壳聚糖巨大的应用价值驱使世界各地的研究者探究壳聚糖及其衍生物在更多领域中的应用。

基于目前壳聚糖在农业中的研究进展和现状，本文综述了壳聚糖在植物病害防控(直接抗微生物活性和间接抗性诱导)、植物生长调控以及采后果实保存中的作用。

1 壳聚糖的抗微生物活性

关于壳聚糖对不同种类微生物(真菌、细菌和病毒)较高的直接抗微生物活性，人们进行了大量研究，结果表明壳聚糖是一种抗微生物物质，可以杀死或抑制微生物的生长[6]。壳聚糖的广谱抗真菌活性已有大量相关研究报道，在离体条件下，壳聚糖可抑制众多病原真菌的生长，如灰霉菌(Botrytiscinerea)、链格孢菌(Alternariaalternata)、赤叶枯刺盘孢菌(Colletotrichumgleosporoides)和匍茎根霉菌(Rhizopusstolonifer)。壳聚糖在病原真菌的不同发育阶段(菌丝生长、产孢、孢子萌发)均可对病原真菌表现出抑制作用，同时也抑制真菌毒力因子的产生[7]。此外，壳聚糖的抗真菌活性也在许多不同的植物-病原物系统中被证实，例如在梨中对苹果链格孢菌和瓶霉属病原菌(P.piricola)的抗性[8]，在葡萄和草莓中对灰霉菌的抗性[9-10]，在火龙果中对赤叶枯刺盘孢菌的抗性[11]。在水稻中壳聚糖对匍茎根霉菌的抗性通过透射电镜观察和致病性试验得到进一步证实[12]。

壳聚糖也可抑制黄单胞杆菌属(Xanthomonas)[13]、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)[14]、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和欧文氏菌(Erwiniacarotovora)[15]等多种病原细菌的生长。然而，壳聚糖对真菌的抗性似乎高于细菌[16]，壳聚糖对革兰氏阳性菌的抗性常常也高于革兰氏阴性菌，这些现象可能是细菌表面不同的结构和细胞壁的组成差异造成的[17]。

除了对真菌和细菌的抗性，壳聚糖还可抑制病毒和类病毒的复制，从而抑制其对植物的侵染[18]，例如有研究报道低聚壳聚糖可在体外破坏烟草花叶病毒粒体结构，并引起病毒粒子发生凝聚，从而降低其侵染性。也有研究表明，低聚壳聚糖可诱导烟草抗病性，抑制烟草花叶病毒增殖，降低植株体内病毒粒子浓度，并抑制烟草花叶病毒在植物体内的移动，明显减弱病毒系统侵染症状[19-20]，但总体来说报道壳聚糖抗病毒活性的研究较少[21]。

尽管目前研究人员已提出了多种关于壳聚糖抗微生物活性的作用模型，但壳聚糖直接抗微生物作用的确切机理仍不清楚[7，17]，这些已提出的模型中壳聚糖的主要作用方式都与壳聚糖的正电性有关[22]，不带电的几丁质低聚物无抗真菌活性也支持这些作用模型[23]。事实上，与壳聚糖不同，聚合物形式的几丁质是天然不带电的，也不表现出显著的抗微生物活性。基于静电相互作用模型，壳聚糖分子氨基质子化所带正电荷与病原物细胞表面组分所带的负电荷相互作用，破坏了细胞膜结构的完整性，引起细胞膜透性增大，导致其屏障功能的丧失、营养物质的流动以及病原物细胞内容物的泄露，从而导致病原物死亡[24-26]。

另一种作用模型涉及到壳聚糖沉积到病原物细胞表面，引起细胞透性的改变，壳聚糖可以在病原物细胞表面形成不可渗透的聚合物层，从而阻止细胞摄取生长所必需的养分，同时影响代谢产物分泌到细胞外基质[17]。

第3种壳聚糖抗微生物模型是基于壳聚糖可螯合一些细菌和真菌生长所必需的养分、金属离子和微量元素[17，27]，从而抑制毒素产生和微生物生长[28]。壳聚糖与金属离子结合的能力很强，壳聚糖所带的氨基是与金属离子结合的主要位点，但这不是壳聚糖抗微生物活性的主因，因为壳聚糖上可以与金属离子结合的位点有限，形成复合物容易饱和，同时细菌和真菌生长对金属离子的需要量极低，基本在痕量水平，而且壳聚糖与金属离子的结合是一个动态平衡过程，壳聚糖是否可以与痕量水平的金属离子作用尚不确定[29-31]。

2 壳聚糖的植物抗性诱导作用

所有植物，无论其是抗病的还是易受病原物侵染的，都可通过诱导1个协调的信号转导系统来应对病原物侵染，从而导致不同基因产物的积累。植物对病原物侵染的反应可在不同层次上发挥作用：首先，植物识别病原物导致植物中局部细胞快速死亡，也称为过敏反应(HR)，导致侵染部位坏死(局部反应)。随后即使是在植物其他未受侵染部位，也会引发广谱而持久的进一步抵抗病原物侵染的系统抗性表达，这导致活性氧(ROS)的产生，同时也伴随着防御相关基因的激活以及与植保素、萜烯类、病程相关蛋白(PR-蛋白)和参与防御反应的多种酶[苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)]产生相关的基因表达上调[32-34]。

可以触发植物防御反应机制的信号分子被称为诱导子或激发子，在植物受病原物侵染部位，激发子可由受侵染植物细胞产生(内源激发子，植物在与病原菌接触时释放)，也可由病原物自身产生(外源病原激发子)。这些激发子主要包括寡糖、脂类、多肽和蛋白质等多种物质，可在低浓度下作为信号分子诱导植物防御反应[35]。一旦激发子被植物细胞跨膜受体识别，通过信号转导分子在植物远端组织转运，可诱导局部反应(在受侵染部位)和系统的免疫反应[36]。随着植物对病原物侵染响应机制的研究增多，研究人员发现可以利用具有诱导子功能的外源物质，人为诱导植物自身的抗性，从而使植物获得广谱病害抗性，增强植物对致病病原物抗性。目前关于激发子处理植物，启动植物抗病原物侵染的诱导抗性已有较多报道[32]。因此，在农业生产中通过使用激发子提高植物抗性，是一种环境友好的植物病害防控方法，可作为化学农药防治植物病害的替代方法或补充措施，从而减少化学农药对环境的负面影响。

较多研究结果表明，低分子量壳聚糖是有效的生物源激发子，能够诱导植物防御反应并激活可提高作物对病害抗性的不同信号转导途径[17，37-38]。目前关于植物对壳聚糖处理的响应中研究最多的是木质素、胼胝质等化学和机械屏障的形成以及参与防御反应有关物质和酶的合成[17，32]。在某些情况下，壳聚糖引起的过敏反应(主要是受侵染部位)，导致程序性细胞死亡[39]。同时，这些过敏反应还伴随着植物防御机制的系统反应，这些系统反应主要包括在防御反应中起积极作用的次生代谢物的合成与积累，如木质素、胼胝质、植保素、病程相关蛋白；参与防御反应代谢途径的关键酶活性的调节，如苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和几丁质酶[40-43]。

壳聚糖诱导植物抗病性的作用机制和壳聚糖在植物与病原物互作中诱导的反应尚未完全探明。植物通过细胞跨膜受体识别激发子，但识别壳聚糖的特异性受体尚未确定，传递信号到转录因子(TFs)的蛋白激酶级联也还未被确定[32]。目前已有研究提出了不同模型来阐述壳聚糖在激活植物防御基因中的作用，在这些模型中壳聚糖诱导植物防御基因的表达上调涉及壳聚糖与DNA的直接相互作用，这些模型认为壳聚糖通过改变DNA的结构(染色结构重组)诱导防御基因激活，伴随着转录因子高迁移率组蛋白(HMG A)减少或与DNA聚合酶复合物的相互作用减少[43-45]。壳聚糖处理诱导的防御反应可能取决于植物-病原物系统差异，即使是同一作物，也会因处理时期和方式的差异而诱导不同防御反应。

3 壳聚糖对植物生长的刺激作用

目前关于壳聚糖在作物生长的应用研究已有较多报道。叶面喷施壳聚糖可提高番茄(LycopersicumesculentumMill)单果质量和产量[46]，增加黄秋葵(HibiscusesculentusL.)的果实产量、株高和叶片数[47]，刺激希腊牛至(OriganumvulgareL.)[48]生长，促进罗勒(OcimumbasilicumL.)组培苗生物量的积累[49]。土壤添加壳聚糖可提高辣椒(CapsicumannuumL.)的株高、冠幅和叶面积[50]。用壳聚糖拌种或在小麦(TriticumaestivumL.)不同生长阶段叶面喷施壳聚糖，通过提高产量性状如穗数和穗粒数影响大规模大田试验小麦产量[51]。此外，壳聚糖可有效增强甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)小孢子胚胎发生和植株再生[52]，还可提高组培条件下美味猕猴桃(ActinidiadeliciosaA. Chev)体细胞胚胎发生[53]。

壳聚糖也能促进花卉生长如壳聚糖处理可提高石斛兰(DendrobiumformosumRoxb.)的种子萌发率[54]；壳聚糖处理唐菖蒲(GladioluscommunisL.)球茎可促进球茎发芽并增加小球茎数量，同时延长瓶插寿命[55]。同样，在小苍兰(Freesiaeckl. ex Klatt)球茎的培养中应用壳聚糖可提高株高，促进叶、芽、花和球茎的生长[56]。壳聚糖处理现代月季(RosachinensisJacq.)“法国红”切花可延长了其瓶插寿命[57]。

关于壳聚糖对水果类作物生长发育影响的研究最多，叶面喷施壳聚糖可促进咖啡(CoffeaarabicaL.)植株生长[58]，也可促进智利草莓(FragariachiloensisL.)营养成长并提高产量[59]。葡萄(VitisviniferaL.)扦插枝条浸在壳聚糖溶液中可促进生根，增加茎节数量[60]。在草莓植株不同发育阶段喷施壳聚糖，可增加所结果实的保质期[61]。壳聚糖处理也可提高番茄植株产量[62]。

壳聚糖也可用来处理果实，通过包膜或浸蘸的方式延长蔬菜、水果的货架期并延缓其变质[63]。壳聚糖在果实表面形成保护层减少水分损失、抑制气体交换、减少养分流失，并防止微生物在果实表面生长[63]。最近的研究结果表明，壳聚糖可延长具有重要商业价值的热带水果如番木瓜(CaricapapayaL.)、芒果(MangiferaindicaL.)等的贮藏期并减少其腐烂[64]。壳聚糖处理柠檬(CitruslimonL.)后，由青霉属(Penicilliumspp.)植物病原真菌引起的柠檬青霉病发病率降低[65]。茉莉酸甲酯与壳聚糖处理智利草莓可保持其较高的果实硬度和花色素苷含量，同时显著延缓其腐烂[61]。壳聚糖包膜处理可延长猕猴桃的货架期[66]。壳聚糖和肉桂醛包膜处理可增强甜瓜(CucumismeloL.)结构的完整性以及抗氧化代谢[67]。壳聚糖包膜处理可提高采后枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)果实品质和营养品质[68]。壳聚糖和水杨酸处理可通过提高黄瓜(CucumissativusL.)果实中的水杨酸水平和抗氧化酶活性，减轻冷储过程中黄瓜冷害的发生[69]。

4 展望

壳聚糖作为来源广的生物聚合物，可以诱导植物产生大量生理响应，如胁迫抗性以及生产力提高，但这些生理响应是否发生，与壳聚糖的化学组成以及处理的时间和频率有关，总体来说壳聚糖在可持续农业实践以及在食品生产和保存中拥有较大发展前景，尤其是壳聚糖在替代杀菌剂等对环境存在污染的化学农药等方面具有较大的应用潜力，在有机农业中由于缺乏有效的方法控制植物病害，壳聚糖的应用前景较大。目前有机农业中植物病害的控制，特别是真菌和细菌病原物引起的植物病害，主要是使用波尔多液等铜制剂防治。然而，由于使用铜制剂存在对环境造成重金属污染的风险，因此寻找环境友好的替代物是必须的。壳聚糖则代表了一种创新的生态友好的措施，可用来控制植物病害并减少或取代铜制剂的使用。较多研究已经表明，壳聚糖可通过直接或间接的作用保护植物免受生物胁迫的伤害，但是壳聚糖与病原物和植物的相互作用机制还未彻底探明。未来须要进一步从转录组学和蛋白质组学角度研究植物防御基因和蛋白，从而充分了解壳聚糖介导的复杂生理响应，以期为在植物病害防治中更好地运用壳聚糖提供参考。同时在实践方面，壳聚糖在大田条件下具体使用方法和使用浓度，特别是与其他杀菌物质的复配是未来研究的焦点问题，并须要进一步试验和验证，以最优化壳聚糖在调控作物生长和植物病害防控方面的效果。