海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠的防护作用*

徐建良 盛国光 张云城 杨 妮

1.湖北省中医院肝病科 (湖北 武汉，430061)2.湖北省中医药研究院 3.深圳市龙岗区中医院 4.湖北中医药大学2018级硕士研究生班

慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是由HBV感染引起的免疫性疾病，导致肝脏损伤的发病机制至今仍未完全清楚。Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型具有肝脏特异性、剂量依赖性和制作简便快捷的特点[1]，被认为是最适合研究人类病毒性肝炎病理机制的研究模型。海珠益肝加味方是盛国光教授治疗CHB的经验方，在前期的临床及实验研究中，发现其具有抑制乙肝病毒复制、恢复肝功能、抗肝纤维化等作用[2，3]，但其机制尚不十分明确。本实验从免疫性肝损伤的角度，探讨海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠防护作用及作用机制。

1 资料与方法

1.1 研究方法

1.1.1 实验动物 昆明小鼠40只,清洁级，5周龄，雄性,体重18～22g，购自湖北省实验动物研究所。

1.1.2 主要药物及试剂 海珠益肝加味方组成：叶下珠、海藻、太子参、枸杞子、白花蛇舌草各15g，茯苓12g，白芥子10g，莪术6g，均购自湖北省中药材公司。按处方加水煎煮两次，混合药液，沉淀过滤，水浴浓缩为含生药1g/ml的药液,分装、灭菌、低温保存，由湖北省中医院制剂室提供。醋酸强的松片由浙江仙琚制药股份有限公司生产(批号H33021207),以生理盐水溶解成0.78mg/ml溶液；Con A购自Sigma公司(批号80M7680V)；ALT、AST、SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所;IL-4、IL-6试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自谷歌生物(批号G2003)；牛血清白蛋白(BSA)购自北京索莱宝科技有限公司(批号A8020);蛋白抽提试剂盒购自谷歌生物(批号G2002)；蛋白浓度试剂盒购自碧云天生物技术研究所(批号P0006)等。

1.1.3 主要仪器 X-OMAT BT医用X射线胶片(柯达XBT-1)，可见分光光度计 (美谱达UV6100S)，纯水仪(AJC-0501-P)，微型旋涡混合器(WH-2)，水浴锅(TL-420D)，酶标仪(RT-2100C)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 将40只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、醋酸强的松组、海珠益肝加味方组,每组10只。各组小鼠适应性饲养两天后，除正常对照组外，其余组小鼠于实验第1天尾静脉注射Con A 20mg/kg(生理盐水稀释,浓度为2mg/ml)。并于第1天开始灌胃给药，醋酸强的松组以醋酸强的松7.8mg/kg灌胃、海珠益肝加味方组以海珠益肝加味方13.4ml/kg灌胃，正常组、模型组以蒸馏水0.2ml/10g灌胃,每天1次,连续3天。末次灌胃给药后4h，模型组、醋酸强的松组、海珠益肝加味方组一次性尾静脉注射Con A 20mg/kg[4]。8h后，摘眼球取血，室温静置2h，低温离心留取血清。颈椎脱臼处死动物摘取肝脏。取肝组织石蜡包埋切片做HE染色。肝组织标本匀浆、离心留取上清。取适量肝组织冻存于液氮，2h后再转移至-80℃低温冰箱，以备作Western-blot检测。

1.2.2 指标检测方法 按各试剂盒说明书的要求测定小鼠血清AST、ALT水平(采用赖氏法)及血清IL-4、IL-6的水平(采用ELISA法)。肝组织MDA、SOD指标的测定分别采用硫代巴比妥酸比色法、黄嘌呤氧化酶法，肝组织NF-κB-p65表达水平的测定采用Western-blot法。

1.2.3 肝组织病理学观察 取各组小鼠肝右叶条形组织块(约0.2g)，用4%中性多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察各组肝组织的病理变化。

2 结果

2.1 各组小鼠血清中ALT、AST、IL-4、IL-6的水平 见表1。

2.2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA及NF-κB-p65水平 见表2。

表2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA及NF-κB-p65水平

与正常组比较，*P<0.05；与模型比较，##P<0.01，#P<0.05

2.3 各组小鼠肝组织病理变化 正常组在HE染色中肝细胞浆均匀红染，细胞核大小正常，核质淡染，肝窦清晰可见，肝索排列整齐。模型组肝组织内大量淋巴细胞浸润，胞质疏松，线粒体肿胀，嵴模糊，内质网轻度扩张，毛细胆管扩张肝窦内大量红细胞淤积，肝板消失、凋亡小体散在、肝细胞脂肪变性。血管周围的肝细胞胞浆疏松，染色变浅，肝窦间隙明显增宽，有的还可见点状坏死、淋巴细胞、中性粒细胞浸润。与模型组比较,醋酸强的松组和海珠益肝方加味组肝细胞肿胀明显减轻，未见明显毛细胆管扩张，线粒体轻度肿胀、嵴存在，内质网无明显扩张。

表1 各组小鼠血清ALT、AST、IL-4、IL-6的水平

与正常组比较，**P<0.01；与模型比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

Con A是一种植物凝集素，在体外激活T细胞的丝裂原，活化T淋巴细胞而致免疫性肝损伤。Imose[5]等报道静脉注射BALB/c小鼠8～12h内可引起明显的肝损害,并证明损伤机制为CD4+T细胞介导的，与人类的病毒性肝炎发病机理十分相近。Con A诱导的肝损伤动物模型是较为理想的免疫性肝损伤动物模型。Con A导致肝损害的机制主要有:存在肝窦内大量的巨噬细胞，激活后产生的细胞因子TNF-α可直接损伤肝细胞，导致肝细胞凋亡、坏死[6];大量活化体内的T淋巴细胞与细胞因子IFN-γ等通过血流到达肝脏，直接或间接与肝细胞接触后，激活巨噬细胞、破坏血管内皮细胞导致肝损伤[7]。

MDA是脂质过氧化反应的最终产物，是反映组织氧化损伤的指标之一，可以间接反映体内氧自由基的代谢状况和机体细胞受自由基攻击的严重程度，其生成量随氧自由基生成的增加而增加。SOD是氧自由基的特异清除剂，能保护细胞免受氧化损害。

肝损伤过程中特别是T淋巴细胞介导的免疫反应容易引起肝细胞内氧自由基的大量产生,进而这些氧自由基作始动因子作用于细胞膜上的脂质,进行脂质过氧化的链所反应。炎症细胞分泌的细胞因子(TNF-α等)将导致肝细胞受到氧化应激损伤，在生理水平上体现为肝细胞抗氧化能力的下降和膜脂过氧化反应的加剧，以及进一步加重的膜损伤[8]。本实验表明,海珠益肝加味方能降低Con A诱导的肝损伤鼠血清中ALT、AST及肝组织中MDA的水平，提高SOD的活性，减轻肝组织的病理损伤，验证了其对免疫性肝损伤小鼠肝脏功能的防护作用。

IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子,以往称为B细胞生长因子,同时也活化细胞毒性T细胞,被认为是典型的由Th2细胞产生的细胞因子,对炎症性细胞因子的释放和这些细胞的杀菌活性有明显抑制作用。IL-6为多效的细胞因子，生理功能复杂，既有促炎作用，又有抗凋亡作用。NF-κB是一组结构上相关的蛋自质家族组成，由p65和p50构成的异二聚体，属Rel蛋白家族成员。NF-κB能与许多细胞因子和炎性介质的基因启动子区域的固定核有酸序列结合，启动转录，在机体免疫应答、炎症反应方而发挥重要作用。p65位于胞质中，在各种肝脏疾病(如免疫性肝损伤和肝癌等)发展过程中均处于激活状态，对治疗肝脏疾病具有明显的作用[9]。有证据证明，具有NF-κB位点并受NF-κB调控的细胞因子基因有TNF-α、IL-2、IL-6 等[10]。抑制p65的表达被作为调节体内免疫反应的一个重要的指标。

海珠益肝方由叶下珠、海藻、茯苓、白花蛇舌草、白芥子、莪术等六味药组成，前期研究提示对免疫性肝损伤小鼠神经-内分泌-免疫网络的干预作用[11]。海珠益肝加味方在海珠益肝方基础上加用太子参、枸杞子组成，是盛国光教授治疗CHB的经验方，具有解毒、化痰、消瘀、补虚的功效[12]。本研究发现，与模型组比较,海珠益肝方加味组NF-κB-p65的水平降低，IL-4、IL-6明显上升，说明海珠益肝加味方能调控免疫反应的NF-κB通路，更好抑制免疫反应，预防、减轻免疫性肝损伤的肝脏炎症，具有保护肝细胞的作用。