MicroRNAs治疗肝癌的方法及相关肝癌模型的研究进展

戴列军 黄新造 费新应

鄂东医疗集团黄石市中医医院(市传染病医院)肝病科 (湖北 黄石，435000)

微小RNA(MicroRNAs)由长度大约为20～24个核苷酸构成，其主要功能是调节蛋白质编码基因的表达。过去十多年中的研究表明它们在肝癌发生中起重要的作用。因此，它们已经成为治疗肝癌潜在的分子和靶标。微小RNA很容易通过全身给药的方法作用于肝脏，因此，肝癌是测试MicroRNAs治疗方法的优秀平台。近年来，人们广泛开展了MicroRNAs治疗肝细胞癌(HCC)的研究，并且建立了这方面的动物模型。这些研究为评估MicroRNAs或抗MicroRNAs的治疗打下了良好基础。总的来说，MicroRNAs的抗肿瘤活性已得到证实，由于没有副作用或仅有轻微的副作用，MicroRNAs的预防性使用也很值得期待。

1 基于MicroRNAs的治疗方法

通过对人类和鼠的全基因表达模式对比分析表明，许多小鼠模型可以重现人类病情中观察到的关键生物和分子事件。因此，小鼠模型被广泛用于测试潜在的治疗靶点，也用于临床前研究[1]。近年来，人们通过抑制MicroRNAs表达或MicroRNAs替换的方法来治疗和预防HCC。

1.1 MicroRNAs抑制疗法 Krutzfeldt及其同事首先表明，使用特定分子可以有效地使MicroRNAs保持沉默，通过静脉使用化学修饰单链RNA(antagoMicroRNA)能够 特异性抑制肝脏MicroRNA-122表达。antago MicroRNAs是经过特殊化学修饰的MicroRNAs拮抗剂，通过与体内成熟MicroRNAs竞争性结合，阻止MicroRNAs与其靶基因mRNA的互补配对，抑制MicroRNAs发挥作用。研究者在非人类灵长动物试验中证实了基因沉默疗法的安全性，没有发现其肝毒性的证据。在此基础上，研究者进行了许多关于MicroRNAs抑制的研究。体外实验证实MicroRNA-221具有促进HCC的作用，在一项可重复性研究中，全身给予胆固醇标记的抗MicroRNA-221分子具有减少原位肝癌细胞增殖的作用，并延长患者的生存期[2]。另一项关于MicroRNA-221的研究发现在TG221转基因鼠模型中，抗MicroRNA-221寡核苷酸表现出显著的抗肿瘤活性，经组织病理学分析证实被治疗小鼠的肿瘤数目和大小显著减少。接受抗MicroRNA-221治疗的小鼠肝组织中MicroRNA-221水平显著下降，从而证实这些分子具有抑制内源性MicroRNA-221的能力(见表1)。Lim等人的工作支持通过调节MicroRNAs水平来治疗肝癌[3]。其中，抑制MicroRNA-494表达(在人类HCC中MicroRNAs过度表达)可以显著减少MYC肝癌模型的肿瘤大小。

表1 基于MicroRNAs的HCC治疗方法

丙型肝炎病毒(HCV)感染慢性化后可发展为肝硬化，进一步可发展为HCC。研究者发现MicroRNA-122具有促进HCV复制的作用[4]。相应地，与MicroRNA-122序列互补的LNA分子可以抑制非人类灵长动物HCV病毒的复制。这些结果支持把MicroRNA-122作为抗病毒治疗潜在靶标[5]。目前研究者正在评估抗MicroRNA-122寡核苷酸“MicroRNAavirsen SPC3649”(Santaris Pharma)治疗HCV感染的作用，已经进入了Ⅱ期临床试验。

1.2 MicroRNAs替代疗法 MicroRNAs替代是另一种可以用来揭示MicroRNAs功能的方法，可以证实MicroRNAs在肿瘤发生中的作用，并为治疗癌症提供辅助手段。其中的一种方法是恢复癌细胞下调表达的MicroRNAs水平。通常使用荷瘤小鼠模型来测试MicroRNAs的抑瘤活性，由腺病毒(AAV)递送的一些纳米级大小的脂质颗粒或胆固醇偶联修饰的寡核苷酸(见表2)。Hou等利用胆固醇偶联的小RNA和AAV递送系统，有效地恢复HCC裸鼠肝组织中的MicroRNA-199a/b-3p表达，抑制肿瘤生长，且没有发现其肝毒性证据。慢病毒(Lentivirus)介导的MicroRNA-199a也能够抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长[6]，证实该MicroRNAs的抗癌作用及其临床应用潜力。

为了建立更好的人类肝癌模型，研究者使用基因工程或化学诱导方法建立了多种小鼠肝癌模型。采用MYC诱导建立的小鼠HCC模型，研究者证实了MicroRNA-26a26和MicroRNA-122[7]的抑瘤活性。在二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠HCC模型中，静脉给予MicroRNA-124后，肿瘤生长受到抑制，其抑瘤作用是通过诱导细胞凋亡以及抑制包含肝细胞核因子4α(HNF4a)的MicroRNAs /炎症信号通路实现的[8]。这些研究表明，MicroRNAs类似物在治疗癌症上表现出良好的前途，可以应用于临床实践中。MRX34(MicroRNAs Therapeutics Inc.)是第一个MicroRNAs类似物药物，它是一种脂质体配方的肿瘤抑制剂miR-34a的模拟物，已经进入多中心 I期临床试验，旨在评估其治疗原发性肝癌或其他肝转移肿瘤的安全性(临床试验注册号：NCT01829971)[9]。

1.3 溶瘤病毒疗法 溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，作用于肿瘤组织，导致癌细胞溶解，而对正常组织仅表现出轻微的毒性。因此，溶瘤病毒疗法是比较有希望的治疗癌症的方法[10，11]。溶瘤病毒能与HCC中表达的MicroRNAs相互作用，由于肿瘤组织与正常组织MicroRNAs表达存在差异，研究者利用这一点提高基于溶瘤病毒疗法的安全性。例如，为了克服静脉使用溶瘤腺病毒的肝毒性，可以将调节性MicroRNA122序列插入到肿瘤特异的增殖型腺病毒(CRAd)基因组中，该病毒不能在正常肝组织复制，但在肿瘤组织中具有复制能力[12]。溶瘤病毒还可以应用于HCC异种移植模型中，有研究者构组建一种let-7依赖性腺病毒，使它只能在肿瘤细胞中复制，而不能在正常肝细胞中复制[13]。此外，MicroRNA-199依赖性肿瘤特异性腺病毒也可以在HCC中细胞复制，在正常肝细胞中不复制。这种病毒既能够抑制裸鼠皮下异种移植肿瘤的生长，也能够抑制免疫健全小鼠中HCC细胞生长，而且没有显著的肝毒性[14](见表1)。

2 肝癌的MicroRNAs特异性动物模型

通过对动物模型的MicroRNAs基因进行修饰来证明MicroRNAs参与癌症的发生和进展，有研究者观察到MicroRNAs在细胞恶变和肿瘤发展中的重要作用，这些模型提供了体内测试MicroRNAs功效的平台(见表2)。

表2 研究MicroRNAs治疗肝癌的动物模型

研究者已经使用了抑癌基因、致癌基因、乙型肝炎病毒或HCV病毒基因开发小鼠肝癌模型[3]，近来有研究报道了基于MicroRNAs的小鼠肝癌模型。TG222小鼠是第一种通过MicroRNAs过度表达诱导实体肿瘤的转基因动物模型[15]有研究者构建了肝脏MicroRNA-221过度表达的转基因小鼠模型经小鼠中雄性动物表现出强烈HCC易患性，随着年龄增长或者经DEN处理后，模型小鼠自发出现结节性肝脏病变和肿瘤。HCC组织中一些MicroRNAs表达下降，因此研究者构建了MicroRNA-122基因敲除的小鼠模型，模型小鼠表现出肝炎、纤维化现象，随着年龄增长还可以自发出现肝肿瘤。这些研究证实MicroRNA-122对肝脏肿瘤的抑制功能，以及其在肝脏代谢和肝细胞分化中的重要性[7,16]。

除了研究这些MicroRNAs特异性模型外，有研究者注意到减少MicroRNAs组件的重要性。比如，DDX20是一种含有MicroRNAs组件的核糖核蛋白复合物，它通过抑制NF-κB活性来调节MicroRNA-140功能[17]，经DEN处理后，MicroRNA-140基因敲除小鼠容易发展为HCC，具有类似于DDX20功能缺陷表型。这表明MicroRNA-140可以通过调节NF-κB通路成为肿瘤抑制因子[18]，进而证实MicroRNAs在肝癌调控中的重要性。

3 讨论

肝细胞癌是最常见的肝癌类型，目前治疗方案取决于肿瘤大小和分期。对于晚期、不可切除的HCC患者，目前有效的方法是使用多激酶抑制剂——索拉非尼。该药物通过靶向作用于酪氨酸激酶受体(VEGFR和PDGFR)以及丝氨酸-苏氨酸激酶(c-RAF和BRAF)，Ⅲ期实验证明索拉非尼能延长HCC患者的中位生存期和无进展生存期[19]。然而，临床上仍然需要更有效且无毒副作用的治疗方法。MicroRNAs或抗MicroRNAs作为肿瘤治疗分子引起了广泛的关注。目前，尽管它们的抗癌有效性仍有待完全证实，它们的短期安全性得到了证实，未来研究要侧重于使用MicroRNAs /抗MicroRNAs寡核苷酸治疗HCC，为此建立的HCC动物模型是检测MicroRNAs /抗MicroRNAs分子有效性的重要平台。