一株好氧反硝化菌的筛选及其脱氮性能研究

张峥 黄家富 覃华静 黄雪容 邓冬梅

摘 要：从柳钢焦化废水A/O生物处理系统的好氧活性污泥中筛选分离出一株具有好氧反硝化能力的菌株f-3.生理生化特征以及16S rDNA序列分析表明，f-3属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）.在通过单因素法考察初始 pH 值、温度、碳氮比（C/N）、投菌量和不同碳源等环境条件对f-3反硝化性能影响的基础上，通过响应面法确定f-3进行反硝化反应的最优环境条件.结果表明：在硝酸钾为唯一氮源、35 ℃、NO3-初始浓度180 mg/L、C/N 10∶1、初始pH 6.0、投菌量2%时，f-3菌株的反硝化性能最优，36 h对NO3-去除率达92.85%；在亚硝酸钠为唯一氮源、NO2-初始浓度280 mg/L、初始pH 4.0、C/N 15∶1、温度35 ℃时，f-3菌株对NO2-降解率最大，36 h对NO2-去除率达68.45%；此外，该菌株在400 mg/L苯酚或400 mg/L喹啉中均能生长，且保存一定的好氧反硝化能力，说明f-3菌株对焦化废水中主要污染物苯酚和喹啉具有一定耐性.

关键词：焦化废水；好氧反硝化作用；菌株；功能筛选

中图分类号：X757 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.008

0 引言

焦化废水是指在煤的高温干馏、煤气净化及化工产品精制过程中所产生的废水，成分复杂，是目前最难处理的工业废水之一[1-2].生物处理法是目前焦化企业应用最广泛和成熟的废水处理技术[3-4].焦化废水中除大量的酚类、联苯和喹啉等难降解有毒污染物外，还有大量氨氮.硝化反硝化组成的脱氮系统由于难降解有机物等环境影响，抗负荷冲击能力差，出水氨氮不稳定，不能稳定达到（GB16171-2012）《炼焦化学污染物排放标准》中焦化废水排放标准.为此，稳定高效的硝化和反硝化功能是目前焦化废水生物处理的主要目标之一.筛选脱氮效率高的菌种，并通过生物强化方式将其应用于焦化废水生物处理，是提高焦化废水生物脱氮效率的主要途径之一.

好氧反硝化菌是一种新型反硝化菌，主要存在于芽孢杆菌属（Bacillus）、副球菌属（Paracoccus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）和假单胞菌属（Pseudomonas）等，多数为好氧或兼性好氧、并以有机碳作为能源的异养硝化菌[5].目前，鉴定新的好氧反硝化菌并考察其反硝化特性是好氧反硝化菌的研究热点.在焦化废水生物处理的活性污泥中，也已发现有好氧反硝化菌的存在，但目前鉴定出能实现焦化废水脱氮的好氧反硝化菌数量很少.因此，本研究希望能够从焦化废水好氧活性污泥中筛选出具有高效好氧反硝化能力的菌种，并使用分子生物学方法进行鉴定其种属，并考察环境因子对其反硝化能力的影响，可为以后对好氧反硝化菌的各种生长特性和脱氮机理进行深入研究提供材料，为将其应用于焦化废水生物脱氮提供依据.

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株筛选自柳钢焦化废水缺氧/好氧（A/O）生物处理系统的O池中活性污泥.

1.2 培养基

细菌富集培养使用溴百里酚蓝（BTB）固体培养基，包含琼脂20 g/L、KNO3 1 g/L、KH2PO4 1 g/L、FeC13·6H2O 0.5 g/L、CaC12·7H2O 0.2 g/L、MgC12·7H2O 1 g/L、琥珀酸钠8.5 g/L、溴百里酚蓝（BTB）0.01 g/L、pH 7.0～7.3.当细菌发生反硝化反应时，培养基pH增加，当pH>7.6时，培养基变蓝色[6].

细菌反硝化性能测定用反硝化培养基A和反硝化培养基B.反硝化培养基A包含KNO3 0.72 g/L，KH2PO4 1 g/L，琥珀酸钠2.8 g/L.反硝化培养基B包含NaNO2 0.6 g/L，KH2PO4 1 g/L，琥珀酸钠2.8 g/L.

1.3 菌种的筛选、分离和保存

取1 mL污泥与9 mL无菌水在锥形瓶中混合震荡，使污泥充分摇碎.破碎后的污泥经梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 稀释，涂布于BTB培养基，恒温箱30 ℃培养36 h.使用BTB固体培养基对已长出的菌落进行平板划线分离.将分离纯化出菌株分别接入反硝化培养基A、B中，150 r/min，28 ℃培养48 h后，分别用酚二磺酸光度法和N- （1-萘基） -乙二胺光度法测定硝酸氮（NO3-N）和亚硝酸氮（NO2-N）[7].筛选到反硝化能力最强的菌株（f-3号菌株）.将纯化的f-3号菌保存在15%的甘油中，存于-60 ℃冰箱中待用.

1.4 菌株鉴定

1.4.1 形态和生理生化实验

参照《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株进行形态观察，并利用温度生长、盐度生长、氧化酶、接触酶、甲基红、吲哚和淀粉分解等实验鉴定菌株生理特性[8].

1.4.2 菌株16S rRNA 鉴定

利用细菌鉴定的通用引物27F 和1492R[9-10]对菌液进行PCR 片段基因扩增，引物由上海生工有限公司合成.反应体系（50 μL）包括：25 μL DNA 聚合酶mix（赛默飞公司，美国），菌液模板4 μL，去离子水17 μL，上下游引物各2 μL.PCR温度程序为：94 ℃预变性8 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环29次，最后72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存.1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用AxyPrep DNA 凝膠回收试剂盒（康宁生命科学有限公司，中国）对PCR产物进行纯化.将纯化的DNA送往上海立菲生物技术有限公司进行序列测定；将序列在NCBI网页上进行BLAST同源性比对.

1.5 菌株生长曲线和好氧反硝化特性

1.5.1 生长曲线分析

菌株经BTB液体培养基活化20 h后按1% 接种量接至50 mL BTB培养基中，于30 ℃和150 r /min 条件下培养，培养过程中每隔4 h取样，测定OD600，绘制生长曲线.

1.5.2 反硝化性能分析

根据单因素实验设计，将f-3菌株置于不同碳源种类、碳氮比、温度、pH和投菌量等条件下，在BTB液体培养基150 r/min条件下培养不同时间后，取出部分菌液在10 000 r /min 下离心5 min，分析上清液中NO3-N和NO2-N的浓度，计算NO3-N和NO2-N去除率.本次实验采用单因素分析法.根据环境单因素实验结果，用Design-Expert软件生成三水平三因素组合条件（如表1所示），然后用spss软件处理数据，计算F（方差）等指标，根据所生成的各组合条件摇床培养菌株，测定培养40 h后f-3菌株对NO3-N和NO2-N的去除率，进一步优化f-3菌株的环境条件，以期获得更好的反硝化性能.

1.6 苯酚和喹啉对f-3菌株反硝化性能影响

配制含有不同浓度苯酚或喹啉的BTB液体培养基，按2%的接种量接种f-3菌株，并在1.5.2中最优条件下培养，每隔6～8 h取样，离心测上清中的NO3-N和NO2-N浓度，计算NO3-N和NO2-N去除率.

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选

利用BTB培养基初筛时，对菌落周围出现较大蓝色晕圈的菌落分离纯化，得到6株菌株，菌株形态见表2.

将分离纯化出的6株菌在分别接入反硝化培养基A、B中，30 ℃培养36 h后，测定其对NO3-N和NO2-N的降解率.如表2所示，在起始NO3-N浓度为233.4 mg/L时，6株菌对NO3-N 降解率均达80%以上，其中，f-3与f-5菌株对NO3-N降解能力最強；6株菌中f-3菌株降解NO2-N能力最强，NO2-N降解率达48%.由于6株菌中，f-3菌株具有较高的NO3-N和NO2-N降解能力，后续试验以f-3菌株为材料进行.

2.2 f-3菌株鉴定和生理生化

如图1所示，f-3菌株革兰氏阴性，在BTB培养基中培养，菌落圆形湿润，可以使BTB培养基变蓝.Blast 结果表明：f-3菌株的16S rRNA 基因序列同Pseudomonas pseudoalcaligenes的相似度最大为99%，结合菌株的形态学和生理生化实验结果（见表3），可以基本确定f-3菌株属于P. pseudoalcaligenes.目前已发现的好氧反硝化菌，如Pseudomonas chengduensis[9]、Pseudomonas aeruginosa，均属于Pseudomonas属，但Pseudomonas pseudoalcaligenes具有反硝化特性尚未见报道.

2.3 f-3菌株生长曲线

如图2所示，在液体BTB培养基中，150 r/min和30 ℃条件下，f-3菌株从4 h左右开始进入对数期，12 h左右进入稳定期，28 h左右开始进入衰亡期.

2.4 环境对f-3菌株反硝化性能的影响

2.4.1 碳源种类对f-3反硝化性能影响

碳源在很大程度上影响着硝酸盐还原酶的活性[10-11].如图3所示，4种碳源中，f-3菌株0～12 h的反硝化能力差别不大，但28 h后反硝化能力有明显差异，其中以琥珀酸钠为唯一碳源时，f-3菌株的好氧反硝化能力最强，培养28 h后，对NO3-N和NO2-N的去除率分别达到91%和50%.这与王世梅等[9]研究结果相似，所以实验均采用琥珀酸钠作为碳源.

2.4.2 碳氮比对f-3菌株反硝化性能影响

本研究以琥珀酸钠为碳源，分别在反硝化培养基中添加不同量的碳源，将C/N值控制在1∶20～1∶1，考察f-3菌株反硝化性能（见图3）.如图4所示，不同C/N下，f-3菌株的好氧反硝化能力有一定区别，以NO3-为氮源时，最佳C/N为8∶1，28 h的去除率达89%，以NO2-为氮源时，最佳C/N为16∶1，36 h的去除率为55%，C/N为12∶1和20∶1时，36 h的去除率也均超过50%.C /N 较低时，可能是因为碳源不足，影响反硝化菌的生长，从而导致反硝化能力较低.达到最适C /N后，继续增加C /N，产生的多余中间产物可能会抑制好氧反硝化进程[12].

2.4.3 投菌量对f-3菌株反硝化性能影响

接种量是影响菌株好氧反硝化功能的重要因素，适当的接种量能有效地提高菌株的反硝化能力.但接种量对f-3菌株反硝化性能影响较小，以NO3-为氮源时，0～28 h内，投菌量越高，反硝化能力越强，28 h后，不同投菌量下，f-3菌株的反硝化能力趋于相同.这可能是因为接种量对菌株反硝化能力的影响可能和细菌数量有关，在生长稳定期，不同接种量的细菌数量类似，其反硝化能力也趋于一致.

2.4.4 温度对f-3菌株反硝化性能影响

如图6所示，以NO3-为唯一氮源时，温度对f-3菌株的反硝化能力有一定影响，其中10 oC时的反硝化能力明显低于其他温度，而在30 oC～40 oC范围内，f-3菌株的反硝能力差别不大，在36 h时，对NO3-的去除率最高，均达90%.而以NO2-为唯一氮源时，10 oC～40 oC对f-3菌株降解NO[-2]能力无明显影响.表明，如实现实际应用，低温环境下f-3菌株对NO2-的去除有很大应用优势.

2.4.5 pH对f-3菌株反硝化性能影响

如图7所示，pH对f-3菌株反硝化性能有较大影响.以NO3-为唯一氮源，pH为6时，f-3菌株的反硝化能力最强，28 h对NO3-去除率达93%.以NO2-为唯一氮源，pH为4时，f-3菌株的反硝化能力最强，36 h对NO3-去除率达59%.据报道，好氧反硝化菌P. stutzeri BMEN1，更适于在偏碱性条件（pH>7）生长和好氧反硝化的实现[13]，本研究中的f-3菌株在酸性条件下反硝化能力更强，其反硝化机制值得进一步探讨.

2.5 苯酚和喹啉对f-3菌株反硝化性能影响

苯酚和喹啉是焦化废水中含量最多的两种有毒有机成分，可对微生物产生毒害.如将f-3菌株应用于焦化废水或其他类似水质废水的脱氮，需要考虑苯酚和喹啉对其反硝化功能的影响.如图8和图9所示，100～400 mg/L的苯酚或喹啉均对f-3菌株的反硝化性能产生抑制作用，且苯酚或喹啉浓度越高，抑制作用越强，且以NO2-为唯一氮源时，f-3菌株反硝化能力受抑制程度高于以NO3-为唯一氮源时的情况.但在400 mg/L的苯酚或喹啉下，f-3菌株仍保留一定反硝化能力，特别是以NO3-为唯一氮源时，对NO3-的去除率分别为50%和46%.表明f-3菌株在焦化废水类似含苯酚或喹啉废水的脱氮处理中有较大应用潜力.

3 结论

1）从焦化废水活性污泥中筛选的f-3菌株具有好氧反硝化功能，经生理生化和分子生物学鉴定，该菌株属于P. pseudoalcaligenes.

2）f-3菌株去除NO3-的最适条件是以琥珀酸钠为唯一碳源在30 oC～40 oC范围内，pH为6，最佳C/N为8∶1.去除NO2-的最适条件是以琥珀酸钠为唯一碳源在10 oC～40 oC范围内，pH为4时，最佳C/N为16∶1.

3）f-3菌株对喹啉和苯酚有一定耐性，在100～400 mg/L的喹啉和苯酚环境下，仍具有一定的反硝化能力.

参考文献

[1]BAI Y H，SUN Q H，XING R，et al.Analysis of denitrifier community in a bioaugmented sequencing batch reactor for the treatment of coking wastewater containing pyridine and quinoline[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，90（4）：1485-1492.

[2]SHI S，QU Y，MA F，et al.Bioremediation of coking wastewater containing carbazole，dibenzofuran and dibenzothiophene by immobilized naphthalene-cultivated Arthrobacter sp. W1 in magnetic gellan gum[J]. Bioresour Technology，2014，166（7）：79-86.

[3]LI H B，CAO H B，LI Y P，et al.Effect of organic compounds on nitrite accumulation during the nitrification process for coking wastewater[J]. Water Science and Technology，2010，62（9）：2096-2105.

[4]MARANON E，VAZQUEZ I，RODRIGUEZ J，et al.Treatment of coke wastewater in a sequential batch reactor （SBR） at pilot plant scale[J]. Bioresour Technology，2008，99（10）：4192-4198.

[5]張小玲，张卫东，张玲，等.好氧反硝化菌的选育及其初步应用[J].微生物学通报，2008，35（10）：1556-1561.

[6]PATUREAU D，BERNET N，DELGENES J P，et al.Effect of dissolved oxygen and carbon-nitrogen loads on denitrification by an aerobic consortium[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2000，54（4）：535-542.

[7]中国环境科学出版社.水和废水监测分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002.

[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[9]朱晓宇，王世梅，梁剑茹，等.两株高效好氧反硝化细菌的分离鉴定及其脱氮效率[J].环境科学学报，2009，29（1）：111 -117.

[10]HEUER H，KRSEK M，BAKER P，et al.Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients[J].Applied Environmental Microbiology，1997，63（8）：3233-3241.

[11]梁书成，赵敏，卢磊，等.好氧反硝化菌脱氮研究进展[J].应用生态学报，2010，21（6）：1581-1588.

[12]杨小龙，李文明，陈燕，等.一株好氧反硝化菌的分离鉴定及其脱氮特性[J].微生物学报，2011，51（8）：1062-1070.

[13]任源，韦朝海，吴超飞，等. 焦化废水水质组成及其环境学与生物学特性分析[J].环境科学学报，2007，27（7）：1094-1100.

Screening and characterization of an aerobic denitrifying bacterium

from the coking wastewater treatment

ZHANG Zheng1， 2， HUANG Jiafu1， 2， QIN Huajing1， 2， HUANG Xuerong1， 2， DENG Dongmei*1

（1. School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006，China； 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources （Guangxi University of Science and Technology），Liuzhou 545006， China）

Abstract： In order to improve the efficiency of denitrification of coking wastewater， an aerobic denitrifying bacterial strain f-3 was screened from aerobiotic sludge sewage in coking wastewater treatment system of Liuzhou Iron and Steel Group Company Ltd. According to the morphological， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis， the strain f-3 was identified as Pseudomonas sp. The influence of the initial pH， temperature， C/N， investment and the amount of bacteria， different carbon sources on the denitrification ability of this strain was then investigated. The best reaction conditions were further optimized by response surface methods. Results showed that at 35 ℃， potassium nitrate as the sole nitrogen source， NO3- initial concentration of 180 mg/L， carbon and nitrogen ratio of 10∶1， initial pH 6.0， inoculum concentration of 2%， the denitrification ability of the strain performance was best and the removal rate of NO3- reached 92.85% after 36 h. When sodium nitrite as the sole nitrogen source， the strain showed best denitrification ability， at 280 mg/L NO2-， pH 4.0， C/N 15∶1， 35 ℃ and the degradation rate reached 68.45% after 36 h. Moreover， f-3 could preserve the ability of aerobic denitrifying to a certain extent even at 400 mg/L phenol or 400 mg/L quinoline.

Key words： coking wastewater； aerobic denitrification； bacterial strain； functional screening

（學科编辑：黎 娅）