超声辅助提取花生壳中白藜芦醇及人工胃肠液对其活性影响

高强 叶云 梁鸿飞 钟英英

摘 要：采用响应面法优化超声辅助提取花生壳中白藜芦醇，以及人工胃肠液对白藜芦醇活性的影响.以乙醇为提取溶剂，选择乙醇用量、乙醇体积分数、超声功率分数、提取时间作为单因素条件，通过响应面法优化并验证提取工艺.最佳提取工艺：乙醇用量50 g、乙醇体积分数50%、超声功率分数45%、超声处理时间10 min，最优条件下，白藜芦醇的提取率为2.166‰.人工胃肠液实验的结果是：白藜芦醇在胃液不降解而在肠液中降解.响应面实验可以优化超声辅助提取花生壳中白藜芦醇，提高提取率.

关键词：花生壳；白藜芦醇；超声辅助；人工胃肠液

中图分类号：TQ353.42；TQ914.1 DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2018.04.010

0 引言

白藜芦醇（resveratrol）广泛分布于植物界，存在于虎杖、葡萄、花生、松树等植物中，其中以虎杖含量最为丰富，白藜芦醇具有抗菌、抗氧化、预防心脏病、抗癌等功效[1].目前白藜芦醇的研究主要集中在虎杖和葡萄等植物中，对花生中白藜芦醇的研究则较少[2].每年大量的花生壳被当作废物丢弃，如果能充分利用，既可以提高花生种植的附加值，又可避免环境污染，使这些原本被废弃的东西成为生产白藜芦醇以及相关保健品的丰富资源[3].Cilibrasi等[4]发现白藜芦醇可以影响Wnt信号通路抑制肿瘤细胞的增殖；Bai等[5]证明了白藜芦醇在体外诱导人T24膀胱癌细胞凋亡和细胞周期阻滞.白藜芦醇对于正常的人体细胞无害，具有高度选择性和药理活性，可以看做除紫杉醇外又一种绿色抗癌药物[6].利用花生壳提取白藜芦醇，可以低成本获取高价值的白藜芦醇.

白藜芦醇有多种提取方式，包括微波辅助、超声辅助和CO2超临界萃取等提取技术[7-8].本文运用超声波辅助法提取白藜芦醇，同时对其进行优化，以期达到最大提取率.而后，采用人工胃肠液模拟体内胃环境对花生壳提取物进行处理，研究其抗氧化活性的变化[9].

1 材料与试剂

1.1 材料

柳州当地获取花生壳原料，洗净后置于60 ℃烘箱中（12 h），粉碎后过60目筛（0.250 mm），密封，阴凉处保存.

1.2 试剂

白藜芦醇标准品购于成都曼思特生物科技有限公司，胃蛋白酶（猪胃黏膜）和胰蛋白酶（牛胰）购于上海源叶生物科技有限公司，其余试剂为国产分析纯.

2 实验方法

2.1 标准曲线及白藜芦醇含量的测定

配置浓度分别是0、2.24、4.48、6.72、8.90、11.20、13.44、15.68 [μ]g/mL的白藜芦醇标准液.在吸收波长为306 nm下测量两次稀释后的每个标准液的吸光度，平行测3次.以吸光度（A）对浓度（c）进行线性回归，计算得回归方程.

根据线性回归方程得到浓度的大小，可计算白藜芦醇的含量：

α=10-6×[c×10×25m×0.6]×1 000‰

α ——白藜芦醇提取率/‰；c ——白藜芦醇的质量浓度（μg/mL）；m——花生壳粉末的质量（g）；25 表示定容到25 mL；0.6 表示量取0.6 mL出来稀释；10 表示量取的样液稀释到10 mL.

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇用量

设置超声功率分数40%，即240 W，提取时间15 min，超声波细胞粉碎机选用6 mm的探针，超声工作时间4 s，间隙时间5 s，报警温度50 ℃，分别以20、30、40、50、60 g的乙醇用量，配置成60%的乙醇溶液来提取白藜芦醇[10].在306 nm下检测吸光度值.

2.2.2 乙醇体积分数

设置超声功率分数40%，即240 W，提取时间15 min，超声波细胞粉碎机选用6 mm的探针，超声工作时间4 s，间隙时间5 s，报警温度50 ℃，选定最佳乙醇用量，分别以40%、50%、60%、70%、80%的乙醇体积分数来提取白藜芦醇[11].在306 nm下檢测吸光度值.

2.2.3 超声功率

选定最佳的乙醇用量和乙醇体积分数，超声波细胞粉碎机选用6 mm的探针，不同的超声功率（30%、35%、40%、45%、50%，即180、210、240、270、300 W），超声工作时间为4 s，间隙时间为5 s，提取时间15 min，报警温度50 ℃，分别提取白藜芦醇[12-13].在306 nm下检测吸光度值.

2.2.4 超声提取时间

选定最佳的乙醇用量、乙醇体积分数和超声功率分数，超声波细胞粉碎机选用6 mm的探针，超声工作时间4 s，间隙时间5 s，报警温度50 ℃，分别设置5、10、15、20、25 min的提取时间来提取白藜芦醇[13].在306 nm下检测吸光度值.

2.3 响应面试验设计

响应面实验通过Design-Expert 8.0.6 Trial 软件 ，在单因素实验结果的基础上选定水平，对乙醇用量（A）、乙醇体积分数（B）、超声功率分数（C）、超声提取时间（D）4因素进行优化实验[14-15].根据Box.Behnken 的中心组合设计原理设计探究实验以及验证实验[16].试验因素及水平见表1.

2.4 人工胃肠液模拟实验

根据体外模拟实验研究胃肠对丁香抗氧化活性物质的活性影响情况，用相同的方法来研究人工胃肠对白藜芦醇活性的影响情况[17].人工肠胃液按照《中国药典》（ 2010 版） 记载的方法配置.

参照刘亚等[18]的方法略做改动，用人工胃肠液处理过筛的花生壳，反应结束后，溶液用乙酸乙酯萃取3次，取上层溶液即乙酸乙酯层浓缩至干，用少许无水乙醇溶解定容到25 mL作为待测液，测吸光度[9，17]，每组测3次.

3 实验结果

3.1 白藜芦醇标准曲线

标准曲线在白藜芦醇浓度为0～15.68 [μ]g/mL处的线性关系很好，得到回归方程为y=0.100 2x+0.009 2，R2=0.999 7，符合使用要求[19]如图1所示.对3次实验求均值，计算与实验结果的最大上下误差.

3.2 单因素实验结果

3.2.1 乙醇用量

由图2可知乙醇用量为50 g时白藜芦醇含量最高，达到1.974‰.

3.2.2 乙醇体积分数

由图3可知，当乙醇体积分数达到50%时，花生壳中的白藜芦醇基本上被完全提取出来，此时的白藜芦醇提取率达到了2.307‰.

3.2.3 超声功率

由图4可知当超声功率分数达到45%，即功率为270 W时，花生壳中的白藜芦醇基本上被完全提取出来，此时的白藜芦醇提取率达到了1.987‰[20].

3.2.4 提取时间

由图5可知，当提取时间达到10 min时，花生壳中的白藜芦醇基本上被完全提取出来，此时的白藜芦醇提取率达到了2.066‰.

3.3 响应面实验

3.3.1 优化实验结果

依据表 1 中的因素与水平值，每个试验组均进行3组平行试验以减少误差，其试验结果见表 2.

对表2中响应面试验结果进行多元回归拟合分析[21].白藜芦醇提取率对自变量乙醇用量（A）、体积分数（B）、功率分数（C）和提取时间（D）的二次多项回归方程模型为：

白藜芦醇提取率=2.25-0.015A+0.049B+0.023C+0.017D-0.020AB+0.017AC-5.000E-0.03AD-0.013BC+0.013BD-0.018CD-0.19A2-0.21B2-0.22C2-0.16D2

3.3.2 方差分析

由表3可知，该回归模型极显著（P<0.000 1），失拟误差 P=0.089 7>0.05，不显著，该回归模型与试验数据的拟合度较高.

根据响应面法试验结果及其回归方程模型分析可知，超声辅助提取花生壳中白藜芦醇的优化工艺条件为：乙醇用量49.61 g、乙醇体积分数51.61%、超声功率分数44.77%、提取时间10.40 min，预测白藜芦醇的提取率能达到2.184‰.按此最佳提取条件进行3次平行实验.考虑到实验操作的实际性，将上述最佳提取条件优化修正为乙醇用量50 g、乙醇体积分数50%、超声功率分数45%、提取时间10 min.在修正条件进行实验得到实际平均提取率2.166‰，与预测值相差较小.

白藜芦醇提取率影响的大小关系为B（乙醇体积分数）>D（提取时间）>C（功率分数）>A（乙醇用量），其中乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响最大，最为显著.

3.3.3 响应曲面分析

利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件中数据进行二次多元回归拟合，得到如图6所示的二次回归方程的响应面图.

响应面图能够直观地观察到各因素交互作用对提取率的影响，响应面坡度越陡，则表明交互作用越显著，反之则表示交互作用不显著.由图6可以看出影响提取率各因子间的交互作用，最佳提取条件以及提取率，乙醇用量（A）以及体积分数（B）的交互作用最大，乙醇用量（A）以及提取时间（D）的交互作用最小，与方差分析结果一致.

3.4 人工胃肠液实验

通过用体外实验的方法模拟白藜芦醇在胃肠液中的吸收情况，并检测其在306 nm下的吸光值（A），观察其白藜芦醇含量变化如图7所示.

经过人工胃液处理的白藜芦醇样液基本没有降解，经过人工肠液处理后的白藜芦醇样液，出现降解.

经过人工胃液处理后白藜芦醇含量提高的原因可能是在pH值较低的胃液环境中，白藜芦醇粗提物中含有的一些多酚或者黄酮类化合物通过水解等一些化合反应生成了一些白藜芦醇苷元，从而提高了白藜芦醇的含量.此实验结果有助于提升体内实验的成功率.

4 结论

花生果壳在日常生活中属于丢弃物，本次实验采用花生壳作为研究材料，通过新型的超声辅助法进行提取，能达到废物利用的效果.

通過单因素实验以及响应面优化实验可以得出，乙醇用量49.73 g、乙醇体积分数51.62%、超声功率分数44.70%、提取时间10.43 min，优化修正后的工艺条件下白藜芦醇的提取率能达到2.184‰.其中乙醇体积分数对白藜芦醇提取率的影响最大，最为显著.对于肠胃液对白藜芦醇活性的研究表明：胃液能抑制白藜芦醇能降解而肠液促进降解.

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Study on ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and the effect of artificial gastrointestinal fluid on its activity

GAO Qiang， YE Yun， LIANG Hongfei， ZHONG Yingying*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： Response surface method was used to optimize ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and the effect of artificial gastrointestinal fluid on resveratrol activity. Choosing ethanol as solvent， ethanol dosage， ethanol volume fraction， ultrasonic power fraction and extraction time as single factor conditions， the extraction process was optimized and validated by response surface method. The optimal extraction process is as follows： ethanol dosage being 50 g， ethanol concentration 50%， ultrasonic power score 45%， ultrasonic time 10 min， under optimum conditions， the extraction rate of resveratrol is 2.166 ‰. The result of the artificial gastrointestinal fluid experiment is that gastric juice can inhibit resveratrol degradation and intestinal fluid promotes degradation. Therefore response surface experiment can optimize ultrasonic assisted extraction of resveratrol from peanut shell and improve the extraction rate.

Key words： peanut shell； resveratrol； ultrasonic assisted； artificial gastrointestinal fluid

（学科编辑：黎 娅）