含 ACC 脱氨酶的植物根际促生菌对月季切花品质与生理的影响

贾 颜， 李 茜， 李新艺， 刘 松， 李芹梅， 黄美娟， 黄海泉

(西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南昆明 650224)

月季(Jacq.)是蔷薇科蔷薇属植物，是常绿或半常绿低矮灌木植物，因四季开花而得名，是世界四大鲜切花之一。切花月季因花型高雅、色彩艳丽，被称为“花中皇后”，在各国花卉市场中占有重要地位，其中花型优美、颜色鲜艳的切花月季卡罗拉深受人们喜爱，且市场需求量较大。切花月季采后易衰老、瓶插寿命短、花朵弯头、花瓣发生褐变等现象是影响其出口的主要限制因素。植物内生菌是指能与寄主一起生存却不影响寄主健康的微生物，主要包括细菌、真菌和放线菌。植物内生细菌是一个庞大的群体，其中蕴含着丰富的资源。目前在植物内生细菌研究中，不同学者从不同植物材料中分离出大量内生细菌，其中含ACC脱氨酶活性的内生细菌能将ACC裂解成-丁酮酸和氨，降低植物体内乙烯合成，从而在促进植物生长、延缓植物衰老以及增强植物抗性等方面具有重要的潜力。漫静等从羊草根际中分离筛选出具有ACC脱氨酶活性的内生细菌，通过回接试验发现其内生细菌对羊草生长具有促进作用。Ali等研究发现，含ACC脱氨酶活性的菌株对香石竹的瓶插效果显著，使用电镜扫描观察其在香石竹中的定殖情况，发现菌株能通过切口进入切花茎内。邓超等研究发现，重瓣百合使用含ACC脱氨酶的PGPR菌株后能有效提高其鲜切花品质并延缓切花衰老进程；Chaouachi等从番茄植株中分离到的芽孢杆菌和肠杆菌能够改善番茄采后品质；田建等从辣椒中分离筛选出的枯草芽孢杆菌能显著提高辣椒采后的保鲜品质。目前，对含ACC脱氨酶的PGPR应用于切花月季采后品质方面的研究未见相关报道。因此，探讨含ACC脱氨酶的PGPR对切花月季采后品质方面的影响具有一定的理论和实践意义。本研究基于课题组前期分离的具ACC脱氨酶活性的PGPR，以花卉市场中热销切花月季品种卡罗拉为试验材料，探讨具ACC脱氨酶活性的PGPR对其采后品质的影响，筛选出对切花月季卡罗拉保鲜效果较好的菌株，为其后续的开发利用及切花保鲜提供一定的基础数据及科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

瓶插试验于2021年3—6月在西南林业大学园林园艺学院实验室进行。本研究所用供试菌株为课题组前期分离筛选的具有ACC脱氨酶活性的4株菌株(分别为F195、L74、F11以及F23)。月季切花卡罗拉于云南昆明斗南花卉市场购买(切花月季于花农处同一批采切，且未经任何处理)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液制备 将试验菌株在无菌环境下分别接种于TSB液体培养基中，28 ℃、200 r/min振荡培养24 h后于4 ℃、8 000 r/min离心15 min，弃上层液体培养基，收集菌体。将收集到的菌株与纯水混合，充分摇匀，配制成为0.015±0.02的PGPR菌液备用。

1.2.2 试验设计 将开花一致的切花月季卡罗拉浸入纯水中，用无菌枝剪在水中斜面45°剪切花枝，留枝长度约30 cm，放入培养瓶中进行瓶插试验。处理分别为F195、F23、L74、F11以及对照(CK)，共计5个处理，每个处理重复3次，分别每2枝插入1个装有250 mL处理液的培养瓶中，处理液为菌液和纯水，用保鲜膜将瓶口密封，根据培养瓶中剩余处理液的多少进行补充。

1.2.3 相关指标的测定 使用游标卡尺及电子天平对花径和鲜质量等指标进行测量；SOD、POD、CAT活性和MDA含量参考李合生的方法测定；脯氨酸(PRO)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量参考高俊凤的方法测定；利用CID CI-900便携式乙烯气体分析仪测定花在5 min内的乙烯释放量(EP)。

1.3 数据处理

使用Excel 2010进行数据的整理及制图，使用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析及多重比较，<0.05代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉瓶插品质的影响

切花体内水分含量的多少对切花品质具有重要的影响。由图1-A、图1-B可知，随着瓶插期的延长，不同菌株处理下鲜质量和花径的总体变化基本一致，均呈先升后降趋势。在瓶插期间，F195菌株在所有的处理中均能显著抑制切花鲜质量的下降，在瓶插8 d达到了最大峰值，与CK相比显著增加了66.78%(<0.05)且能显著推迟达到最大花径的时间，并延长瓶插寿命(图1-C)。其中F195菌株与其他处理相比花径最大，在瓶插8 d时达到最大花径，并显著高于CK，增加了43.53%，达到最大花径的时间与CK相比延长了4 d，瓶插寿命延长了4～5 d，与CK相比均达到显著差异水平(<0.05)。其他不同菌株处理下均能不同程度地抑制鲜质量的下降、增大花径，其中效果最好的是F195菌株。

2.2 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉保护酶活性的影响

由图2可知，随着瓶插时间的延长，POD、SOD和CAT活性总体变化一致，均呈先升后降趋势，变化幅度差别较大，且与CK相比存在显著性差异(<0.05)。3种抗氧化酶在菌株F195中均能保持高活性，在瓶插6 d达到了所有处理中的最大峰值，且与CK相比分别提高了173.54%、100.76%和32.25%，在6 d后逐渐出现缓慢下降的趋势。除此之外，菌株F23与L74变化趋势基本一致，并分别对POD和SOD活性的促进作用次于菌株F195，但高于CK，分别高出CK 1.18倍、0.63倍和0.83倍、0.79倍，而在菌株F11处理3 d后POD活性开始呈下降趋势，且与CK相比趋势较为相似。由此说明，使用含ACC脱氨酶的菌株F195有助于显著提高切花月季卡罗拉3种保护酶的活性。

2.3 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉MDA含量的影响

由图3可知，不同菌株对切花月季卡罗拉的瓶插处理结果表明，其MDA含量均呈上升趋势，且经过不同菌株处理后MDA含量与CK相比存在显著性差异(<0.05)。在瓶插12 d时， 不同菌株处理与CK相比分别降低了52.22%、31.72%、23.99%和37.57%，其中，菌株F195处理时MDA含量上升较缓慢，一直处于较低水平，且总体波动不大，而其他菌株处理 MDA 含量则在 CK 与菌株F195之间波动，其MDA含量高于菌株F195并一直随时间的延长而递增，且菌株F23和L74表现较为相似。由此说明，菌株F195可以在一定程度上降低卡罗拉瓶插期间的 MDA 含量，延缓细胞膜系统损伤程度，增强其抗逆性。

2.4 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉乙烯释放量的影响

由图4可知，不同菌株处理均能降低卡罗拉乙烯释放量，同时也延缓了乙烯释放量最大峰值的发生。在瓶插6 d时对照的乙烯释放量达到高峰，峰值为1.6 μL/L，而其他菌株处理在瓶插9 d时达到高峰，峰值分别为0.88、1.03、1.11、1.22 μL/L，对照中乙烯释放量显著高于其他菌株处理(<0.05)，同时各不同菌株处理间乙烯释放量差异显著(<0.05)，其中在瓶插9 d时菌株F195处理乙烯释放量最低，比CK低30.71%；F11、F23和L74次之，分别比CK低3.94%、18.90%和12.60%，可见含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉的乙烯释放量均有抑制作用，其中最佳菌株为F195。

2.5 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉细胞渗透调节物质含量的影响

由图5-A、图5-B可知，不同菌株对切花月季卡罗拉瓶插处理期间，可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈现先升后降的趋势，且与CK存在显著性差异(<0.05)。从图5-A可以看出，CK于瓶插后3 d可溶性蛋白达到高峰后开始逐渐下降，峰值为11.36 μg/g，而其他菌株处理在瓶插6 d时达到高峰后才开始逐渐下降，较CK峰值分别增加123.36%、76.80%、42.57%和55.13%，其中菌株F195的含量最高，为25.38 μg/g。而可溶性糖含量中CK和菌株F11二者均于瓶插处理后3 d达到高峰后开始逐渐下降，其中CK下降幅度较大，峰值分别为9.85、11.31 mg/g，而其他3株菌株处理时在瓶插6 d达到高峰后呈现不同程度下降，且显著高于CK，其中以菌株F195为最高，较CK峰值增加80.35%(图5-B)。由此表明，含ACC脱氨酶的PGPR菌株在一定程度上可以有效缓解卡罗拉的可溶性蛋白和可溶性糖含量减少，延缓蛋白水解，从而达到延缓切花衰老并提高其观赏品质的目的。

由图5-C可知，卡罗拉在瓶插期间，不同处理间脯氨酸含量总体呈现上升趋势，随着瓶插时间延长而逐渐升高，且 CK 增幅最快，经过不同菌株处理后脯氨酸含量与CK相比存在显著性差异(<0.05)，在处理12 d时，分别比对照降低了72.95%、61.20%、28.42%和51.37%，但在菌株F23和L74处理下的脯氨酸含量呈现相似的变化趋势。从瓶插处理开始后，使用菌株处理的脯氨酸含量始终低于CK处理，其中以菌株F195处理最低，且与其他处理间差异均达到显著水平，由此说明，菌株处理能延缓卡罗拉中脯氨酸的积累，进而改善水分平衡，其中以菌株F195处理时效果最为显著。

2.6 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉采后品质的综合评价

2.6.1 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉生理生化指标的主成分分析 将含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉的8个生理生化指标进行主成分分析，综合反映不同PGPR菌株对卡罗拉瓶插寿命状态的影响。由表1可知，共提取了2个主成分(PC1、PC2)，主成分1(PC1)的贡献率为64.11%，主成分2(PC2)的贡献率为27.84%，提取的前2个主成分的累计贡献率为91.95%，其中SOD(0.43)在成分1中载荷最高，其次SS(0.42)、SP(0.40)、CAT(0.40)及POD(0.37)在成分1中也具有较高的载荷；EP(0.60)在成分2中载荷最高，其次MDA(0.52)在成分2中载荷也较高，因此抗氧化酶活性(SOD)及乙烯释放量(EP)可作为评价不同PGPR菌株对卡罗拉瓶插寿命的首选指标。

表1 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对切花月季卡罗拉生理指标的主成分分析

2.6.2 含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对卡罗拉生理生化指标的聚类分析 为了进一步确定不同菌株对切花月季卡罗拉的采后保鲜效果，对其最具代表性的瓶插6 d(盛花期)中不同处理下生理生化指标进行进一步的聚类分析(图6)，从图中可以看出，在欧氏距离为25时，可以将不同的处理聚为3类，其中以保鲜效果较差的CK为第Ⅰ类，保鲜效果中等的菌株F23、L74和F11为第Ⅱ类，保鲜效果较好菌株F195为第Ⅲ类，说明含ACC脱氨酶的PGPR菌株在不同程度上能较好地延长其瓶插寿命，其中菌株F195处理效果最好。

3 结论与讨论

具ACC脱氨酶活性的PGPR菌株可以缓解乙烯对植物的伤害，因此在促进植物的生长、提高植物的抗性以及延缓植物的衰老等方面具有广阔的应用前景，现已成为目前国内外的研究热点之一。Naing等使用阴沟肠杆菌()提高了香石竹瓶插寿命；Carlson等研究发现了2株菌(和)可以提高切花百日菊采后品质。本研究通过使用课题组前期筛选出的含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对切花月季卡罗拉进行瓶插处理，结果表明不同的菌株处理与CK相比能有效提高卡罗拉的瓶插寿命，其中菌株F195对卡罗拉的各项生理生化指标综合表现效果为最佳，能较好地延缓切花衰老进程，提高其观赏品质。

切花植物的瓶插寿命、鲜质量和花径等是评价其观赏价值的重要指标。本研究发现在不同菌株的处理下鲜质量和花径均呈先升后降趋势，且均高于CK，与章志红等使用保鲜液处理对切花牡丹鲜质量和花径的研究结果相似。在不同处理中切花的瓶插寿命差别较大，其中菌株F195处理下切花瓶插寿命最长，可达12 d左右，均优于其他处理，这与张溢等使用植物生长调节剂6-BA对切花月季瓶插寿命的研究结果基本一致。因此可以看出，菌株F195显著地提高了切花的观赏品质，对延长切花的瓶插寿命起到了重要的作用。切花体内含有的抗氧化酶活性较高代表切花中有较好的抵御自由基等有毒害物质的能力，能够降低膜脂过氧化的损伤，从而减少MDA含量的积累。本研究发现，在CK和不同菌株处理下SOD、POD和CAT活性变化趋势均呈先升后降，彼此间变化幅度差别较大，且差异显著(<0.05)，与罗琦等使用保鲜剂对香石竹及胡小京等使用水杨酸对金鱼草切花保鲜中的抗氧化酶活性处理趋势相似。在瓶插期间，刚开始活性先上升可能是因为切花脱离母体后需要一个适应过程，所以导致活性增高，在不同处理下CK和菌株F11所呈现的POD活性在瓶插 3 d 达到最大峰值后呈逐渐下降趋势，而其他菌株处理在瓶插6 d后开始呈现下降趋势，与CK相比，不同菌株处理的3个活性均保持在高水平，这可能是由于含ACC脱氨酶活性的PGPR可以使其抗氧化酶系统迅速做出反应，彼此之间相互协调共同抵御或清除自由基，从而延缓切花衰老。MDA活性随时间的延长呈不断上升趋势，与邓超等使用促生菌对重瓣百合和年林可等使用保鲜剂对牡丹切花MDA含量的处理结果相似，均呈上升趋势，其中CK的MDA含量一直高于其他菌株处理，菌株F195上升较缓慢，一直处于较低水平，这说明使用含ACC脱氨酶活性的菌株处理可以减轻膜损伤的程度。主成分分析表明，SOD、POD和CAT在主成分1中有较高载荷，而MDA活性在主成分2中有较高载荷，这表明抗氧化酶活性及MDA活性可作为评价对卡罗拉保鲜效果的重要指标。

切花体内可溶性糖和可溶性蛋白的含量是决定其观赏品质的重要指标。一般来说，可溶性糖和可溶性蛋白含量越高，说明切花中所含的营养成分也越多，观赏品质也越高。在本研究中发现，可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈先升后降趋势，但CK一直处于较低水平，与韩琴等使用保鲜剂对山茶鲜切花可溶性糖及可溶性蛋白的处理相似，呈先升后降的趋势。在瓶插过程中，经CK和菌株F11处理后可溶性糖含量在瓶插3 d后开始下降，而其他菌株处理在瓶插6 d后开始呈现下降趋势，说明在瓶插过程中，糖含量先升高后降解，降解速度越快，切花衰老速度也越快。通过其他菌株处理后可以不同程度地延缓切花体内可溶性糖和可溶性蛋白含量的减少，从而延缓切花衰老，特别是菌株F195处理对提高可溶性糖和可溶性蛋白的效果最为显著。脯氨酸作为有效的渗透调节物质之一，可以反映切花失水程度。本研究发现，脯氨酸含量随着瓶插时间延长总体呈上升趋势，且CK一直处于最高水平，菌株F195一直处于最低水平，与杨景雅等采用化学保鲜技术对绣球花中脯氨酸处理结果相似，一直呈上升趋势。随着瓶插时间的不断延长，失水程度越严重，导致脯氨酸含量上升也越快，因此，菌株F195处理与其他处理相比失水较少，从而增加切花的保鲜效果。主成分分析表明，可溶性糖和可溶性蛋白在主成分1中具有较高载荷，这表明可溶性糖和可溶性蛋白也可作为评价卡罗拉保鲜效果的重要指标。

乙烯作为一种植物体内普遍存在的内源激素，与切花衰老密切相关，而月季属于典型的乙烯敏感性花卉。本研究发现，乙烯释放量随着时间延长总体呈现先升后降的趋势，与魏富娟等使用生长调节剂对百合切花处理中的乙烯释放量处理结果相似，而与叶迪等使用可利鲜对切花牡丹的研究结果存在一定差异，切花牡丹中的乙烯释放量呈先下降后上升的趋势，这可能与不同植物对乙烯的敏感程度不同有关。在瓶插过程中，CK在6 d时达到乙烯释放量的最大峰值，而不同菌株处理在9 d时达到最大峰值，其中CK一直处于最高水平，而菌株F195处于最低水平，因此，菌株F195与其他处理相比可以较好地抑制乙烯释放，其他菌株与CK相比也可以不同程度地延缓乙烯释放的时间，从而能够延缓切花衰老。主成分分析表明，乙烯释放量在主成分2中载荷最高，由此也可以说明乙烯释放量可作为评价切花衰老的的重要指标。聚类分析表明，菌株F195对卡罗拉的保鲜效果最为显著，可以进一步证明菌株F195抑制乙烯的效果最佳，同时也可以表明菌株F195在延缓切花卡罗拉衰老的进程中起到重要作用。

综上所述，含ACC脱氨酶的不同PGPR菌株对切花月季卡罗拉保鲜效果的影响参差不一，适宜的菌株可以有效地提高切花抗氧化酶活性及具有降低自由基损伤的能力，从而达到延缓切花衰老，延长其瓶插寿命。因此，对于不同的花卉植物应探索不同的内生菌及其菌株应用效果，以便进一步提高切花的采后品质，达到更为理想的保鲜效果，为不同功能性菌种资源的开发利用及花卉保鲜技术提供一定的基础数据和理论依据。