Box—Behnken响应面法优化徐长卿配方颗粒挥发油—β—CD包合物制备工艺

高杰 李哲 李雪利 高晗 屈云萍 李军山

摘 要：为了解决徐长卿挥发油加油难及加入后的稳定性问题，采用Box- Behnken响应面法，优选出徐长卿配方颗粒挥发油-β-CD包合物的制备工艺。在单因素试验的基础上，采用3因素3水平Box-Behnken设计对徐长卿配方颗粒挥发油-β-CD包合工艺进行优选，以挥发油包合率及包合物收率为考察指标，考察挥发油与β-CD比例、包合温度、包合时间对结果的影响。结果表明：优选的包合工艺条件为挥发油与β-CD质量比为1∶8.34，包合温度为50.2 ℃，包合时间为2.17 h。在此条件下，挥发油包合率为72.19%，包合物收率为75.06%，综合评分为96.41，RSD值为1.1%。优选的包合工艺包合率高，工艺稳定可行，可为配方颗粒挥发油的工业化生产提供数据支持。

关键词：中药药剂学；徐长卿；配方颗粒；Box-Behnken 响应面法；β-CD；包合工艺

中图分类号：：R284.2 文献标志码：A

文章编号：1008-1534（2018）05-0377-06

徐长卿为萝藦科植物徐长卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag的干燥根及根茎，可祛风、化湿、止痛、止痒，用于风湿痹通、胃痛胀满、牙痛、腰痛、跌扑伤痛、风疹、湿疹等病的治疗[1]。徐长卿主要含有甾类化合物及挥发性成分。有文献报道，丹皮酚是徐长卿挥发油的主要成分，占比高达90%[2]。目前，徐长卿配方颗粒生产过程中挥发油的加入采用手工喷壶方法，存在溶油耗时、加入不均匀及花粒等问题，同时中间产品储存过程及包装后随着储存时间的延长，挥发油会因慢慢挥发而造成损失。为了解决徐长卿挥发油加油难及加入后的稳定性等问题，对徐长卿挥发油β-CD包合工艺进行了探索研究。近年来中国多采取正交设计优化中药挥发油的包合工艺，试验次数较少，但精度不高。响应面法作为一种新型的试验设计方法，具有试验次数少、精度高、预测值接近真实值等优点，应用范围愈加广泛[3-4]。笔者采用响应面法，选择挥发油包合率及包合物收率为考察指标，以挥发油与β-CD质量比、包合温度、包合时间为影响因素，确定徐长卿配方颗粒挥发油的包合工艺[5-8]，为工业化生产提供数据支持。

1 材料与仪器

1.1 材料

徐长卿挥发油，批号为16062311，神威药业集团有限公司提供；95%（体积分数，下同）乙醇，分析纯，批号为160107，天津市申泰化学试剂有限公司提供；β-CD（β-环糊精），批号为160409，安徽山河药用辅料股份有限公司提供；丹皮酚对照品，批号为110708-201506，中国药品生物制品检定所提供。

1.2 仪器

EMS-20磁力搅拌水浴锅，江苏金坛市仪都仪器有限公司提供；CPA225D分析天平，赛多利斯公司提供；JM-A5002电子天平，浙江余姚市纪铭称重校验设备有限公司提供；水循环真空泵，上海申生科技有限公司提供；DHG-9140A热风循环鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司、太仓精宏仪器设备有限公司提供；LC-20AT高效液相色谱仪，岛津仪器设备有限公司提供；KH3200E型超声波清洗器，江苏昆山禾创超声仪器有限公司提供。

2 试验方法

2.1 徐长卿配方颗粒挥发油的提取

取徐长卿饮片200 g，加入8倍量的水，保持微沸状态水蒸气蒸馏，提取至挥发油不再流出，得到油水混合物。将得到的油水混合物放入4 ℃冷藏库内放置24 h，使油水自然分层，分离回收挥发油层，即得。

2.2 徐长卿配方颗粒挥发油包合物的制备

2.2.1 徐长卿配方颗粒挥发油乙醇溶液的制备

取徐长卿配方颗粒挥发油，加入等量95%的乙醇进行溶解，混合均匀后备用。

2.2.2 β-CD饱和水溶液的制备

称取各试验方案中规定量的β-CD，加入处方量的纯化水，在各方案规定的温度下制成饱和水溶液，保温，备用。

2.2.3 徐长卿配方颗粒挥发油包合物的制备

将制备好的β-CD饱和水溶液置于EMS-20磁力搅拌水浴锅内，按各试验方案设定的包合条件进行包合。将徐长卿配方颗粒挥发油乙醇溶液缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，待挥发油乙醇溶液全部加入后开始计时，继续搅拌至规定时间，放至室温，于4 ℃冷藏24 h，抽滤，用20 mL无水乙醇洗涤3次，置于热风循环鼓风干燥箱内，于45 ℃干燥5 h。

2.3 包合物收率及挥发油包合率的测定

2.3.1 挥发油包合率测定

1）丹皮酚含量测定[9-10]

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂，甲醇-水（二者体积比为45∶55）为流动相，检测波长为274 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，理论板数按丹皮酚计算应不低于3 000。

对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品适量，加入甲醇制成0.1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品约0.1 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻线，超声30 min，放至室温，补加甲醇至刻度，过滤，取续滤液作为供试品溶液，即得。

2）線性关系考察

精密吸取丹皮酚对照品溶液8，12，20，30，40 μL，按前述色谱条件测定，记录峰面积，并以峰面积对对照品进样量作图，绘制标准曲线，得到回归方程为y=4 764.9x-62 504，R2=0.999 9。结果表明，丹皮酚在844.8～4 224 μL范围内线性关系良好。线性关系如图1所示。

3）精密度试验

精密吸取同一对照品溶液10 μL，按前述色谱条件重复进样6次，丹皮酚对照品峰面积值的RSD值为0.4%（n=6），表明仪器的精密度良好。

4）重现性试验

取同一包合物，按前述方法制备供试品溶液，平行操作6次，测定丹皮酚峰面积，计算平均含量为104.7 mg/g，含油率为12.35%，RSD值为0.2%。

5）稳定性试验

取同一包合物，按前述方法制备供试品溶液，分别于室温下0，2，4，8，12 h进样，测定丹皮酚峰面积，结果得到RSD值为0.28%，说明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

6）回收率试验

取同一批已知含量的样品6份，各0.1 g，采用加样回收法，精密加入一定量的丹皮酚对照品，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件进行含量测定，并计算加样回收率。结果得到平均回收率为99.97%，RSD值为0.36%。

7）挥发油包合率

分别精密吸取对照品溶液与徐长卿配方颗粒挥发油各10 μL，注入液相色谱仪测定，得到空白回收率为83.64%。再分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，得到样品的实际含油量。挥发油包合率=包合物实际含油量/（挥发油空白回收率×投油量）×100%[8]。

2.3.2 包合物收率测定

包合物收率=包合物质量/（β-CD质量+投油量）×100%[8]。

2.3.3 评价指标

以挥发油包合率和包合物收率的综合评分为考察指标，2个指标的权重为6∶4，综合评分=（挥发油包合率/挥发油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40[9]。

3 结果与分析

3.1 单因素考察试验

3.1.1 β-CD与纯化水比例的影响

称取β-环糊精3份，各20 g，分别加入120，160，200 g的纯化水，置于磁力搅拌水浴锅内，于60 ℃制成饱和水溶液。将徐长卿配方颗粒挥发油1 g与乙醇溶液1 mL混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，搅拌2 h，放冷，放入冰箱中冷藏24 h，抽滤，用20 mL无水乙醇洗涤3次，于45 ℃干燥5 h。测定挥发油包合率及包合物收率，结果如图2所示，可以看出，β-CD与纯化水质量比为1∶8时综合评分最高。

3.1.2 挥发油与β-CD比例的影响

称取β-环糊精4份，各12 g，加入96 g纯化水，置于磁力搅拌水浴锅内，于60 ℃制成饱和水溶液。分别将徐长卿配方颗粒挥发油2，1.5，1.2，1 g与等量乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，搅拌2 h，放冷，放入冰箱中冷藏24 h，抽滤，用20 mL无水乙醇洗涤3次，于45 ℃干燥5 h。测定挥发油包合率及包合物收率，结果如图3所示，可以看出，β-CD与挥发油质量比为8∶1时综合评分最高。

3.1.3 包合时间的影响

称取β-环糊精4份，各12 g，加入96 g纯化水，置于磁力搅拌水浴锅内，于60 ℃制成饱和水溶液。将徐长卿配方颗粒挥发油1.5 g与等量乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，分别搅拌1，2，3，4 h，放冷，于冰箱中冷藏24 h，抽滤，用20 mL无水乙醇洗涤3次，于45 ℃干燥5 h。测定挥发油包合率及包合物收率，结果如图4所示，可以看出，包合时间为2 h时综合评分最高。

3.1.4 包合温度的影响

称取β-CD 4份，各12 g，加入96 g纯化水，置于磁力搅拌水浴锅内，分别于40，50，60，70 ℃制成饱和水溶液。将徐长卿配方颗粒挥发油1.5 g与等量乙醇溶液混合均匀，缓慢滴入β-CD饱和水溶液中，搅拌2 h，放冷，放入冰箱冷藏24 h，抽滤，用20 mL无水乙醇洗涤3次，于45 ℃干燥5 h。测定挥发油包合率及包合物收率，结果如图5所示，可以看出，包合温度为50 ℃时综合评分最高。

3.2 响应面优化法试验设计及结果分析

依据Box-Behnken的中心组合设计原理，考虑单因素试验的结果设计自变量，以挥发油包合率和包合物收率的综合评分为响应值，通过响应面分析进行徐长卿配方颗粒挥发油β-CD包合工艺条件的优化。

3.2.1 因素选择

在单因素试验基础上，选取对挥发油包合率和包合物收率的综合评分影响显著的3个因素（挥发油与β-CD比例（A）、包合时间（B）、包合温度（C）），采用3水平的响应面分析法进行试验设计，因素水平编码见表1。

3.2.2 响应面试验

利用Design-Expert8.0.5软件进行试验设计，本试验共含有17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点。Box-Behnken试验方案及结果见表2。

3.2.3 模型的建立及方差分析

采用Design-Expert8.0.5软件对综合评分结果进行二次多元回归拟合，回归方程为

Y=95.53+2.59A+0.16B+1.62C+1.10AB+0.82AC-0.27BC-7.95A2-9.70B2-5.09C2，相关系数R2=0.990 5。对该模型进行方差分析，结果见表3。

表3方差分析结果表明，该模型具有极显著水平，足以拟合试验数据。失拟项不显著（P>0.05），说明试验误差小，可信度高，因此可以用于徐长卿配方颗粒挥发油β-CD包合工艺的分析和预测。

3.2.4 響应面分析

由方差分析结果可以看出，AB交互效应显著，AC和BC交互效应不显著，等高线图及效应面图见图6。从综合评分考虑各个因素的影响程度大小为因素A（挥发油与β-CD质量比）>因素C（包合时间）>因素B（包合温度）。

3.3 响应面优化徐长卿配方颗粒挥发油β-CD包合工艺条件

利用Design-Expert 8.0.5软件分析给出的最优干燥工艺为挥发油与β-CD质量比为1∶8.34，包合温度为50.2 ℃，包合时间为2.17 h。在此工艺条件下，综合得分为95.899。

3.4 最佳工艺参数的验证

在优选出的最佳工艺条件下进行验证试验（n=3），得到包合物收率为75.06%，挥发油包合率为72.19%，综合得分为96.41，RSD值为1.1%。因此，试验结果与模型预测值基本一致。

4 结 论

1） 挥发油性质不稳定、易挥发，具有刺激性，溶解性差，故成药性差。将环糊精与挥发油包合后，可增加药物的稳定性及挥发油的溶解度[11]，减少了挥发油的挥发，还可掩盖不良气味[12]。因此，环糊精包合技术被广泛用于挥发油的制剂过程。

2） 通过单因素试验和响应面分析，对徐长卿配方颗粒挥发油β-CD包合工艺进行了优化，打破了中药配方颗粒制备过程中挥发油的传统加入方式，增强了药物的稳定性及服药适应性[13]，得到了挥发油与β-CD比例、包合温度、包合时间对包合物收率、挥发油包合率的回归模型，通过分析证明所建模型有效。

3）响应面法通过试验数据模拟出非线性的曲面模型，预测试验最优方案[14-15]。利用Box-Behnken的中心组合设计原理，可使工作量大为减少，快速准确地优化出最佳包合工艺。

4）客观评价了徐长卿配方颗粒挥发油β-CD的包合过程，避免了因主观因素对试验结果造成的误差，但关于挥发油加入方式对产品药理作用产生的影响尚待今后作进一步的研究。

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