拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因的克隆与分析

李长春 王永 姚国新 戴余军 李国元

摘要：【目的】克隆拟环纹豹蛛热休克蛋白20基因（HSP20），并分析其在镉胁迫下的表达情况，为揭示蜘蛛抵御重金属胁迫机制提供参考。【方法】以拟环纹豹蛛雌蛛为试验材料，在转录组测序的基础上，通过RT-PCR克隆拟环纹豹蛛HSP20基因（PpHSP20），用生物信息学方法对其序列特征进行分析，并采用荧光定量PCR检测镉胁迫下PpHSP20基因的相对表达量。【结果】克隆获得的PpHSP20基因编码区长525 bp，编码174个氨基酸，其编码蛋白分子量20.08 kD，等电点5.97，具有小分子热休克蛋白家族典型的α-晶状体蛋白结构域，与温室拟肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum）α-晶体蛋白A有较高的相似性（58%）。荧光定量PCR分析结果显示，镉胁迫下PpHSP20基因的表达量显著增加（P<0.05）。【结论】拟环纹豹蛛HSP20基因在抵御镉胁迫中发挥调控作用，可作为研究蜘蛛抵御镉胁迫的重要候选基因和潜在的生物标记物。

关键词： 拟环纹豹蛛；HSP20基因；基因克隆；荧光定量PCR

中图分类号： S186；Q956 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1525-06

0 引言

【研究意义】小分子热休克蛋白（Small heat shock protein， sHSP）是自然界中含量最丰富的一类分子伴侣，在动植物和微生物中广泛存在，除参与细胞正常生理活动外，在细胞应激状态下高效表达，对抵御环境胁迫具有重要作用（Hilton et al.， 2013； King and Macrae， 2015）。环境重金属污染是一种普遍现象，在我国以农田镉污染尤为突出，部分污染区土壤镉含量远高于现行《土壤环境质量标准》（GB 15618—1995）规定的限量值，对生态系统和人体健康造成了严重威胁（Wei and Yang， 2010； He et al.， 2013）。蜘蛛普遍存在于各种生境中，其种类多、数量大、繁殖快（申效诚等，2013）。近年来，人们发现活跃的游猎型蜘蛛可积累并耐受高浓度的镉，是环境毒理学研究的理想材料（Shao et al.， 2006； Yang et al.， 2016）。拟环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）在我国农田广泛分布，是一种重要的农业害虫天敌（Lou et al.， 2013）。因此，研究拟环纹豹蛛小分子热休克蛋白的结构与功能，对明确蜘蛛抵御重金属等环境胁迫的机制，以及利用蜘蛛作为重金属污染指示生物等均具有重要意义。【前人研究进展】熱休克蛋白（Heat shock protein， HSP）是生物体受到刺激后大量合成、结构高度保守的应激蛋白，在细胞抵御环境胁迫及维持正常功能过程中发挥重要作用（黄建芳等， 2015）。根据分子量大小、结构和功能，HSP通常被分为6个家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和sHSP（Snoeckx et al.，2001）。其中，sHSP的分子量一般在12～43 kD，结构上没有其他家族保守，但具有共同的α-晶状体蛋白结构域（α-crystallin， ACD）（Van et al.， 2001）。近年来，已在果蝇（Drosophila melanogaster）、家蚕（Bombyx mori）、中华稻蝗（Oxya chinensis）和斜纹夜蛾（Spodoptera litura）等昆虫中开展了sHSP结构和功能的研究（寇利花等， 2015）。Morrow等（2004）研究发现，果蝇线粒体HSP22蛋白能保护其线粒体中其他蛋白和影响其衰老进程，HSP22的过量表达能显著增强其抵御氧化损伤的能力。Liu等（2013）从柞蚕（Anthe-raea pernyi）体内克隆获得一个编码186个氨基酸的HSP21，并通过RT-qPCR和Western印迹法证明其在柞蚕热耐受过程中发挥重要作用。You等（2014）研究发现，紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）sHSP24.1基因的表达量随镉浓度的增加和胁迫时间的延长先升高后降低，推测sHSPs在镉初始胁迫时发挥了保护作用，应激后则虫体内其他解毒系统开始发挥作用。寇利花等（2015）用不同浓度Cd2+对中华稻蝗5龄若虫染毒处理后，利用RT-qPCR进行定量检测，结果发现其精巢和卵巢中5个sHSP基因在镉急性诱导下以不同的模式表达，表达量与镉的浓度和作用时间有关。【本研究切入点】本课题组前期的研究发现重金属镉可在拟环纹豹蛛体内大量富集，并对其生长繁殖和生理代谢产生显著影响（Li et al.， 2016a），但对蜘蛛抵御重金属胁迫的具体机制了解不多，有关拟环纹豹蛛sHSP基因序列分析和镉胁迫下差异表达的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】在借助高通量测序技术获得的拟环纹豹蛛转录组数据基础上（Li et al.， 2016b），筛选出HSP20基因拼接序列，采用RT-PCR获得其全长cDNA序列，用在线生物信息学方法对其序列特征进行分析，并采用荧光定量PCR检测0.2和2.0 mmol/L CdCl2胁迫下HSP20基因的相对表达量，为深入揭示蜘蛛抵御重金属胁迫机制提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

拟环纹豹蛛亚成蛛采自武汉马鞍山森林公园（东经114°31′，北纬30°52′），单头置于试管后放入人工气候箱中饲养，饲养温度（26±1）°C、相对湿度70%、光照周期14 L∶10 D。参考前期研究，在雌蛛成熟2 d后，用0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液进行饮用水染毒处理，以ddH2O为对照。每处理3个生物学重复，每个重复不少于6头蜘蛛（Li et al.，2016a， 2016b）。处理7 d后液氮速冻保存备用。

RNA提取试剂盒、PrimerScript?RT Reagent Kit With gDNA Eraser基因组DNA去除及反转录试剂盒、dNTPs Mixture、Ex Taq酶和DL2000 DNA Marker购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；EasyPure? Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、pEASY?-T1 Cloning Kit克隆载体、Trans 5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；SanPrep柱式质粒小量提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Gray-96G基因扩增仪购自上海山富科学仪器有限公司；Bio-Best 200M凝胶成像系统购自美国西蒙公司；ViiaTM 7实时荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 RNA提取及cDNA合成 参照SanPrep柱式质粒小量提取试剂盒说明提取拟环纹豹蛛雌成蛛的总RNA，并反转录合成cDNA。

1. 2. 2 HSP20基因扩增 根据转录组测序获得的拟环纹豹蛛HSP20基因（PpHSP20）序列用Primer 5.0设计引物[HSP20-F（5'-GCGACTCGGGTTGAAAAAGCTG-3'）和HSP20-R（5'-TTCACTGGTCGTCCC

CTTTTAATG-3'）]，以拟环纹豹蛛cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系20.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，MgC12（25 mmol/L）1.6 μL，dNTPs Mixture（10 μmol/L）1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃延伸7 min。

1. 2. 3 基因克隆与测序 扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，EasyPure? Quick Gel Extraction Kit回收后连接克隆载体pEASY?-T1 Cloning Kit，轉化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选阳性克隆。阳性克隆送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序。

1. 2. 4 生物信息学分析 用NCBI BLAST工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行BlastP分析，采用在线软件NCBI ORF Finder分析克隆基因的开放阅读框（ORF），用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam）分析编码蛋白质的分子式、分子量和等电点等，用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale）分析该蛋白序列的疏水性，用SWISS-MODEL数据库（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测蛋白序列的三级结构，采用MEGA 5.2中的Neighbour-Joining法构建系统发育树，其中Bootstrap值设为1000。

1. 2. 5 Cd胁迫下PpHSP20基因表达分析 以0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作饮用水处理拟环纹豹蛛雌成蛛7 d后，合成处理组和对照组蜘蛛的cDNA作荧光定量PCR检测模板。用Primer 5.0设计定量分析引物，[PpHSP20-F（5'-CCGGAAGAACTGCAGGTGAAGGT-3'）和PpHSP20-R（5'-CGTCGTTTCGTTCCTCGTGCTT-3'）]，参照SYBR Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus， ROX plus）说明进行定量分析。反应体系20.0 μL，其中SYBR Premix Ex Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环；60～95 ℃用于标准曲线分析。所有样品进行3次生物学重复。用β-actin基因为内参，内参引物为：β-actin-F（5'-TGTCGCCTTGGACTTTGAGC-3'）和β-actin-R（5'-CATTGCCGATGGTGATAACT-3'）。反应结束后，用2-ΔΔCt法计算处理组和对照组各基因的表达水平。不同浓度镉胁迫下PpHSP20基因表达量差异用Students-t检验，采用SPSS 20.0进行数据显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 PpHSP20基因扩增结果

在前期对拟环纹豹蛛转录组测序和组装的基础上，挑选一条被注释为HSP20/α-晶体蛋白家族的unigene（c98797.graph_c0）。根据该序列设计的特异性引物，以拟环纹豹蛛雌成蛛总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。电泳检测图谱（图1）显示，约在700 bp处扩增出清晰、明亮的条带，与预期结果相符，琼脂糖凝胶回收PCR产物后克隆到pEASY?-T1 Cloning Kit克隆载体，并转化大肠杆菌Trans 5α感受态细胞。将菌落PCR筛选的阳性克隆送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序，所得序列长度为716 bp，经Genetool比对显示碱基序列与转录组测得碱基序列一致，命名为PpHSP20。

2. 2 PpHSP20基因及其推导氨基酸的序列分析结果

将获得的序列在GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行在线分析，结果（图2）表明，所克隆的PpHSP20基因包含一个525 bp的完整ORF，编码174个氨基酸。利用NCBI BLASTp检索PpHSP20基因编码蛋白的氨基酸序列，分析结果表明，拟环纹豹蛛HSP20与温室拟肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum） α-晶体蛋白A（XP_015904099.1）和桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）HSP21.6（ARQ14800.1）具有较高的相似性，分别为58%和51%。

2. 3 PpHSP20基因编码蛋白的生物信息学分析结果

利用NCBI Conserved Domains在线软件分析蛋白保守结构域，结果（图3）发现PpHSP20蛋白具有典型的α-晶体蛋白结构域，由约80个氨基酸组成，含有12个预测的二聚体形成接触位点，且同源区域属于Hsps-p23样超家族。利用GenBank的ProtParam在线软件预测拟环纹豹蛛HSP20的分子式为C885H1366N252O270S7，分子量为20.08 kD，等电点为5.97，包含20种氨基酸，蛋白质不稳定系数分别为58.61，为不稳定蛋白。

PredictProtein预测拟蛋白的二级结构，其中PpHSP20蛋白无规则卷曲占比为58.62%，延伸链占比为27.01%，α-螺旋占比为14.37%。SWISS-MODEL预测蛋白三级结构表明，PpHSP20编码的氨基酸序列与数据库中蛋白4ydz.1.B匹配相似度为39.22%，匹配氨基酸数目为65～165个，GMQE值为0.41，QMEAN值为-1.34。ProtScale预测发现拟环纹豹蛛PpHSP20蛋白第105位氨基酸亲水性最强，平均分值为-0.679，表明为亲水性蛋白（图4）。

将PpHSP20蛋白序列与家蚕（Bombyx mori） HSP20.4（NP_001037038.1）、黑脉金斑蝶（Danaus plexippus）HSP19.8（OWR44131.1）、苹果蠹蛾（Cy-dia pomonella）HSP19.8（ADX96000.1）、梨小食心虫（Grapholita molesta）HSP21.4（AKS40075.1）、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）HSP21.7（ABE57139.1）、南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrensis）HSP20（ABE57137.1）、长尾水青蛾（Actias selene）HSP20.8（ALI87024.1）和温室拟肥腹蛛 HSP beta-1-like（XP_015921832.1）等节肢动物的sHSP氨基酸序列进行多重比较，利用Neighbour-Joining法构建系统发育进化树，结果（图5）发现拟环纹豹蛛HSP20与温室拟肥腹蛛HSP beta-1-like聚为一小支，并与鳞翅目的黑脉金斑蝶和苹果蠹蛾两个HSP19.8聚为一类，而双翅目的2种斑潜蝇聚为一小支后，与其他几种鳞翅目的昆虫聚为一类。

[ L.sativae Hsp21.7 ][ L.huidobrensis Hsp20 ][ A.selene HSP20.8 ][ B.mori HSP20.4][ G.molesta HSP21.4][ P.pseudoannulata HSP20][ P.tepidariorum HSP beta-1-like ][ D.plexippus HSP19.8][ C.pomonella HSP19.8 ][100][100][70][58][48][47][0.2]

2. 4 镉胁迫下PpHSP20基因的表达分析结果

通过荧光定量PCR分析雌成蛛PpHSP20基因在0.2和2.0 mmol/L CdCl2溶液作饮用水处理7 d的表达情况，结果（图6）显示，在0.2和2.0 mmol/L CdCl2胁迫下PpHSP20基因的相对表达量明显提高，分别是对照组的4.5和7.9倍。2.0 mmol/L CdCl2处理下PpHSP20基因相对表达量显著高于0.2 mmol/L CdCl2处理组（P<0.05），表明镉胁迫诱导了拟环纹豹蛛体内HSP20基因的表达。

3 讨论

sHSP家族保守性不如Hsp70和Hsp90等其他热休克蛋白家族，其至少包括9个亚类，且所有sHSP的C端均含有一个80～100个氨基酸的α-晶状体蛋白保守结构域，该结构域通常含有7～8个反相平行的β-折叠片，在分子识别和分子伴侣功能上发挥重要作用，是鉴定sHSP家族成员的重要特征，在分子进化分析上也具有重要意义（Van et al.， 2001； Sun and MacRae，2005）。本研究从拟环纹豹蛛中克隆获得HSP20的cDNA序列，通过Protein BLAST工具分析，预测的擬环纹豹蛛HSP20第65个氨基酸与第147个氨基酸间具有sHSP典型的α-晶状体蛋白结构域，并与温室拟肥腹蛛α-晶状体蛋白A、桔小实蝇HSP21.6序列具有较高的相似性，表明所获得的序列为拟环纹豹蛛小分子热休克蛋白基因。在PpHSP20蛋白的ACD区域含有12个预测的二聚体形成接触位点，可能与PpHSP20单体二聚体化有关。二聚体是sHSP形成多聚体的基本单位，而sHSP以多聚体形式执行生物学功能为特征（Dudich et al.，1995；Brophy et al.， 1999）。

重金属进入细胞后能直接或间接破坏胞内蛋白结构（Stadtman and Levine， 2003； Rani et al.， 2014）。sHSP作为分子伴侣，可与胁迫造成的非正常蛋白结合，防止它们彼此聚集（Nakamoto and Vigh，2007）。已有研究表明，重金属等环境压力会引起生物体sHSP基因表达的改变（Sun and MacRae， 2005）。4种不同的片脚类动物Gmelinoides fasciatus、Eulimnogammarus cyaneus、E. vittatus和Ommatogammarus flavu在镉胁迫下其sHSP基因均表现为上调表达的趋势（Shatilina et al.， 2010）。扇贝（Argopecten irradians）在Cu2+、Pb2+和Cd2+处理10 d后HSP22表达量显著上调（Zhang et al.， 2010）。黑鲫（Carassius carassius）肾脏中HSP30表达水平与水质变化一致，表明肾脏HSP30的表达可作为环境水质变化的生物标记（An et al.， 2014）。镉是我国农田主要的重金属污染物，对生态系统和人体健康造成了严重威胁（He et al.， 2013）。本研究中镉胁迫下拟环纹豹蛛HSP20表达量明显增加，可能与因镉胁迫造成的结构异常蛋白质结合，从而在环境压力缓解后，在其他热休克蛋白帮助下促使这些蛋白重新折叠成正常结构（Nakamoto and Vigh， 2007）。

4 结论

拟环纹豹蛛HSP20基因编码区长525 bp，编码蛋白含174个氨基酸残基，理论分子量20.08 kD，等电点5.97，具有亲水性和小分子热休克蛋白家族典型的α-晶状体蛋白结构域。荧光定量PCR分析显示镉胁迫下拟环纹豹蛛HSP20基因表达量显著增加，表明其在抵御镉胁迫中发挥作用，可作为研究蜘蛛抵御镉胁迫的重要候选基因和潜在的生物标记物。

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（責任编辑 麻小燕）