大鲵抗菌肽基因KK1/KK5/KK8对嗜水气单胞菌的侵染响应

王慧 杨文佳 骆建林 李国勇 张婷 白禹 李灿

摘要：【目的】探究大鲵（Andrias davidianus）抗菌肽家族基因对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）侵染的响应，为揭示抗菌肽家族基因的功能提供理论依据。【方法】通过腹腔注射嗜水气单胞菌感染大鲵后，采用Trizol提取组织总RNA，反转录合成cDNA，再以实时荧光定量PCR（qPCR）分析抗菌肽家族3個基因（KK1、KK5和KK8）在大鲵皮肤和肝脏器官的表达响应情况。【结果】经腹腔注射嗜水气单胞菌后，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8在大鲵皮肤组织中的相对表达量在攻毒后12～36 h均显著高于注射PBS的对照组（P<0.05，下同）；而在肝脏组织中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量分别在攻毒后24、12和24 h时显著高于对照组，其他时间点均低于对照组，说明这3个抗菌肽基因在早期积极响应嗜水气单胞菌的侵染，但相对于皮肤组织，其高表达量持续时间较短。【结论】抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水气单胞菌侵染大鲵时积极作出应答，尤其在皮肤组织中的特异表达对启动机体天然免疫应答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

关键词：大鲵；嗜水气单胞菌；抗菌肽；响应；基因表达

中图分类号： S947.3 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1627-06

0 引言

【研究意义】抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）广泛存在于多种生物体内，且种类繁多，是生物体非特异性免疫功能的重要组成部分，具有抗细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种生物学功能，尤其在生物体的天然免疫系统中发挥重要作用（Bals et al.，1998；单安山等，2012；王青等，2016），即AMPs在疾病诊疗等方面有着广阔的应用前景。因此，了解AMPs对揭示病原感染免疫应答机制及制定有效控制措施具有重要意义。【前人研究进展】AMPs是免疫系统防御病原微生物入侵的一个重要组分，具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点，一度被认为是新型的药物试剂。已有研究表明，成熟的AMPs具有广谱抗菌活性以抵抗细菌、病毒和真菌的侵染（Ko?ciu-czuk et al.，2012；Gao et al.，2015；Wei et al.，2015）。AMPs作用于细菌的细胞膜，在细胞膜上形成跨膜的离子通道，造成细胞内容物泄露而导致细菌死亡。除此之外，AMPs在寄主的每个生命活动阶段均发挥调节作用，如抑制细胞凋亡，促进伤口愈合，或激活免疫细胞以调节适应性免疫反应（Nagaoka et al.，2001；Zuyderduyn et al.，2001；Bowdish et al.，2004）。两栖类动物的AMPs主要存在于皮肤、胃黏膜和小肠细胞中。田晓乐（2004）研究证实，在非洲爪蟾皮肤和胃黏膜腺体上皮细胞中发现的蛙皮素（Magai-nins），其微克分子浓度即可杀灭革兰氏阳、阴性细菌及真菌和原生动物，甚至可在不伤害体细胞或红细胞的情况下杀死肿瘤细胞。邹黎黎（2008）报道，林栖蛙皮肤抗菌肽demasepin 1是由34个氨基酸残基组成的阳离子亲水脂多肽，对不同致病微生物包括细菌、酵母、原生动物和丝状真菌均具有抑制活性。Lu和Chen（2010）研究发现，欧亚蛙和北美蛙的esculentin-l、ranalexin-l和ranatuerin具有广谱的抗细菌和抗真菌活性，且呈低溶血活性。与其他两栖类动物一样，大鲵皮肤含有丰富的生物活性肽，如抗菌肽和抗氧化肽等（Suraprasit et al.，2014；Xu and Lai，2015；Yang et al.，2017）。【本研究切入点】大鲵（Andrias davidianus）隶属于有尾目（Caudata）隐鳃鲵科（Cryptobranchidae）大鲵属（Andrias），是现存两栖类动物中个体最大、最珍贵的物种，被认定为国家二级野生保护动物（周小愿等，2012）。由于大鲵地位的特殊性及原始结构的独特性，已成为当前研究生物进化、物种多样性、性别决定分子机制等科学问题的理想材料（崔丹等，2017），但目前针对大鲵抗菌肽的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】通过腹腔注射嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染大鲵后，采用实时荧光定量PCR（qPCR）分析抗菌肽家族3个基因（KK1、KK5和KK8）在大鲵皮肤和肝脏器官的表达响应情况，为研究大鲵抗菌肽家族基因对细菌性病害的免疫功能及其抗病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验于2017年9月～2018年2月在贵阳学院生命科学与资源环境学院完成。嗜水气单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，大鲵幼苗购自贵州省黔梦科技有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 试验菌悬液配制 将嗜水气单胞菌接种于LB培养基上，37 ℃培养24 h后，接种于LB液体培养基中，37 ℃摇床培养24 h，以紫外分光光度计检测OD600=0.6，对应的菌悬液浓度为1×108 CFU/mL。

1. 2. 2 大鲵病原菌接种试验 供试大鲵规格250～300 g/尾，随机分成4组，每组15尾，暂养1周后无任何病变方可用于接种试验。第一组为对照组，接种PBS（0.5 mL/尾）；第二组接种嗜水气单胞菌悬液（试验组），接种剂量为0.5 mL/尾。分别在攻毒后12、24、36和48 h从对照组和试验组中各取3尾大鲵，无菌解剖后取其皮肤和肝脏组织速冻于液氮中，备用。

1. 2. 3 RNA提取及cDNA合成 冻存组织采用Trizol提取总RNA，具体步骤参照Trizol试剂盒说明。提取后用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，并使用核酸蛋白仪（Eppendorf）检测总RNA浓度。以反转录试剂盒RT Reagent Kit（TaKaRa）进行反转录，反转录过程中向样品总RNA加入1.0 μL DNA-Eraser后置于PCR仪中，随后加入反转录复合物和引物进行混合，混合终体积10.0 μL，样品混匀后在PCR仪（37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）进行反转录。cDNA反转录后-20 ℃保存备用。

1. 2. 4 qPCR定量分析 按SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明，在Bio-rad CXF96荧光定量PCR仪上进行定量分析，引物序列详见表1。qPCR反应体系20.0 μL，包括SYBR Green PCR Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。扩增程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s；65 ℃下采集荧光信号，进行40个循环。每个样品重复3次。

1. 3 统计分析

采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001；史黎黎等，2016），应用SPSS 17.0中的单因素方差分析对数据进行统计分析，并以SigmaPlot 13.0制图。

2 结果与分析

2. 1 大鲵组织总RNA质量检测和浓度测定结果

检测从大鲵皮肤和肝脏抽提的总RNA质量，当OD260/OD280在1.8～2.0时即为合格样品。以1%琼脂糖凝胶电泳25 min，紫外凝胶成像系统记录结果（图1）显示，检测样品均清晰可见RNA的2条主带（28S rRNA和18S rRNA），说明抽提获得的大鲵组织总RNA分子完整性好，可用于后续研究。

2. 2 qPCR的扩增特异性

通过qPCR定量分析，发现大鲵抗菌肽家族3个基因（KK1、KK5和KK8）的扩增曲线均出现明显指数增长期（图2），表明针对抗菌肽家族基因KK1、KK5和KK8设计的qPCR扩增引物特异性强，且扩增效果良好，可用于后续研究。

2. 3 抗菌肽基因KK1在接种嗜水气单胞菌大鲵组织中的表达情况

采用qPCR分析抗菌肽家族基因KK1在接种嗜水气单胞菌大鲵皮肤和肝脏中的响应情况，结果表明，大鲵抗菌肽基因KK1在皮肤和肝脏组织中均有表达（图3）。在皮肤组织中，抗菌肽基因KK1的相对表达量在攻毒后12～36 h较对照组显著上调（P<0.05，下同），尤其在攻毒后24 h的相对表达量较对照组上调16.44倍。在肝脏组织中，除攻毒后24 h的抗菌肽基因KK1相对表达量较对照组上调5.53倍外，其他攻毒时间点则表现为下调表达。

2. 4 抗菌肽基因KK5在接种嗜水气单胞菌大鲵组织中的表达情况

qPCR分析结果表明，大鲵抗菌肽基因KK5在皮肤和肝脏组织中均有表达（图4）。在皮肤组织中，抗菌肽基因KK5的相对表达量在攻毒后12～48 h较对照组显著上调，尤其在攻毒后24 h的相对表达量较对照组上调7.10倍。在肝脏组织中，除攻毒后12 h的抗菌肽基因KK5相对表达量较对照组上调3.60倍外，其他攻毒時间点则表现为下调表达。可见，大鲵皮肤组织中的抗菌肽KK5较肝脏组织中的KK5更积极响应嗜水气单胞菌侵染，但响应速度不及肝脏组织中的KK5快。

2. 5 抗菌肽基因KK8在接种嗜水气单胞菌大鲵组织中的表达情况

qPCR分析结果表明，大鲵抗菌肽基因KK8在皮肤和肝脏组织中均有表达（图5）。在皮肤组织中，抗菌肽基因KK8的相对表达量在攻毒后12～48 h较对照组显著上调，其中攻毒后48 h的相对表达量是对照组的123.08倍。在肝脏组织中，攻毒后24 h的抗菌肽基因KK8相对表达量较对照组上调8.45倍，攻毒后36 h的相对表达量则显著下调，为对照组的13.37%；其他时间点试验组和对照组间的相对表达量差异不显著（P>0.05）。

2. 6 抗菌肽家族基因不同组织响应分析结果

对大鲵抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水气单胞菌侵染后不同时间点的相对表达量进行分析，发现在大鲵皮肤组织中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量在攻毒后12～36 h均显著高于对照组；而在肝脏组织中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量分别在攻毒后24、12和24 h时显著高于对照组，其他时间点均低于对照组，说明这3个抗菌肽基因在早期积极响应嗜水气单胞菌的侵染，但相对于皮肤组织，其高表达量持续时间较短。由此推测，在嗜水气单胞菌侵染大鲵的过程中，皮肤组织抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在其免疫系统中发挥着更重要的作用。

3 讨论

当动物机体遭受外界病原物侵染时，机体会作出相应的免疫应答，调动体内相关免疫因子共同抵抗外界病原物的入侵，以恢复和保证机体的健康状态。抗菌肽在机体的免疫系统中发挥多种功能作用，广泛分布于动物体的各组织器官中，对多种病原微生物均有抑制作用，有些抗菌肽甚至具有抗寄生虫、病毒和肿瘤的作用（Bals et al.，1998；黎铭等，2017）。可见，抗菌肽在疾病治疗等方面具有广阔的应用前景（王霞，2015）。皮肤暴露外表，是抵御微生物感染的第一线防线（Murakami et al.，2002）。已有研究证实，两栖类动物的粒状皮肤腺体能合成并释放出多种抗菌肽物质，提供有效和快速的微生物防御作用（Duda et al.，2002；Xu and Lai，2015）。本研究结果表明，大鲵皮肤组织中抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量在攻毒后12～36 h均显著高于对照组；而在肝脏组织中，抗菌肽基因KK1、KK5和KK8的相对表达量分别在攻毒后24、12和24 h时显著高于对照组，其他时间点均低于对照组。其中，抗菌肽家族基因KK1和KK8在大鲵皮肤响应嗜水气单胞菌的侵染比在肝脏组织中更积极。说明抗菌肽在皮肤中的特异表达对启动机体天然免疫应答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

嗜水气单胞菌隶属于气单胞菌科（Aermonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是环境中常见的细菌种类之一，可引起人类、畜禽及水生动物等感染致病（王霞，2015；覃俊奇等，2018），其感染大鲵主要引发腹水病、腐皮病、败血症或烂腿病等（周小愿等，2012）。本研究通腹腔注射嗜水气单胞菌感染大鲵，并分别在攻毒后12、24、36和48 h随机挑取大鲵进行取样检测，结果发现抗菌肽基因在健康大鲵皮肤和肝脏组织中已有表达，但经腹腔注射嗜水气单胞菌后抗菌肽基因的表达量发生明显变化。同时，通过对比大鲵皮肤和肝脏两种组织中抗菌肽基因的响应，发现皮肤组织在不同时间点更积极响应嗜水气单胞菌的侵染。注射嗜水气单胞菌能促使大鲵抗菌肽基因表达量上调，说明免疫系统对外界病原微生物的入侵已作出应答，即抗菌肽在大鲵免疫系统抵御外界病原微生物感染的过程中发挥重要作用。该结论为揭示抗菌肽在病原菌侵染大鲵机体的响应机制提供了理论依据。

4 结论

抗菌肽家族基因KK1/KK5/KK8在嗜水气单胞菌侵染大鲵时积极作出应答，尤其在皮肤组织中的特异表达对启动机体天然免疫应答抵抗病原微生物感染具有重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）