大豆皂苷对卵巢癌细胞耐药性的影响

陆春晓，崔 越，何冬旭，马 鑫

(江南大学1.药学院和医学院，2.国家重点工程实验室，江苏 无锡 214122)

越来越多研究表明，食用大豆能预防心血管类疾病以及癌症的发生，这主要得益于大豆中的生物活性物质，如异黄酮、皂苷、植物甾醇等。其中，大豆皂苷具有防老化、抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用[1]。大豆皂苷属于齐墩果烷三萜类化合物，是两亲性分子。目前，已研究确认了18种大豆皂苷，根据其化学结构可分为A类、B类、E类和DDMP类[2]。研究发现几种常见的大豆皂苷：Bb、Bc、Ba、βg、βa、Ab、Ac，在大豆中含量较高[3]。近年来，研究者们也在不断探索发现这些常见的大豆皂苷在多种疾病中的重要作用。大量研究表明，大豆皂苷在肿瘤发生、发展中具有重要作用，可抑制肺腺癌、淋巴癌、肥大细胞癌等细胞系Spc-A-1、YAC-1、P815的DNA合成，从而抑制肿瘤细胞的增殖，并且对人红白血病细胞K562和结肠瘤细胞HCT-15具有杀伤作用[4]。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞向间质细胞转化的现象，这种现象在胚胎形成与器官发育、组织修复与器官纤维化以及肿瘤的发生发展中均有发生[5]，涉及Wnt、TGF-β、Notch、PI3K/Akt等多种信号通路[6]。EMT现象与肿瘤细胞的转移和耐药性密切相关[7]。有研究表明，Raptor通过诱发EMT，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移[8]。Jenchlinger等[9]的研究发现，MAPK通路的激活在引发EMT现象的同时，也增加了多药耐药基因2的表达。本文主要研究了大豆皂苷减弱耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX的EMT现象，降低细胞的迁移能力及其耐药性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 大豆皂苷购自上海源叶生物科技有限公司；N-cadherin、E-cadherin抗体，购自Abcam公司；荧光二抗购自英潍捷基(上海)股份有限公司；DAPI染料购自上海碧云天股份有限公司；Cell Title-Blue@ Cell Viability Assay购自Promega公司。

1.1.2仪器 全功能微孔检测仪(BioTek公司)；凝胶成像仪(Bio-Rad公司)；激光共聚焦显微镜(Leica公司)；正置显微镜、倒置显微镜(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX由本实验室构建。细胞在含体积分数为0.10胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基，5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2细胞活力检测 A2780/PTX细胞分别用DMSO或100 mg·L-1大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac处理48 h。将处理过的细胞以7 000个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，弃原培养基，加入不同浓度(0.01～500 mg·L-1)的紫杉醇处理48 h。每孔加入10 μl Cell Title-Blue溶液，继续培养4～6 h后，使用全功能微孔检测仪于激发光560 nm，发射光590 nm处检测荧光值，用GraphPad Prism5软件计算IC50值[10]。

1.2.3蛋白免疫印迹 提取A2780/PTX和加100 mg·L-1大豆皂苷Ac处理48 h后的耐药细胞的蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上，用0.05 kg·L-1BSA室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤4次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，TBST洗涤4次，每次10 min，ECL显色液显色，通过凝胶成像仪观察大豆皂苷Ac处理后，细胞中N-cadherin、E-cadherin的表达变化。

1.2.4激光共聚焦检测 A2780/PTX细胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac处理48 h，分别接种适量未处理和处理后的A2780/PTX细胞于共聚焦小皿中，待细胞长到60%～70%融合时，加体积分数为0.04的多聚甲醛固定30 min；PBS洗涤3遍，用体积分数为0.002的Triton X-100通透10 min；PBS洗涤3遍，0.05 kg·L-1BSA封闭30 min；一抗4℃孵育过夜；PBS洗涤3次，每次10 min，荧光二抗室温孵育1 h；PBS洗涤3次，每次10 min，DAPI孵育10 min；PBS洗涤3次，每次5 min，使用激光共聚焦显微镜检测荧光强度。

1.2.5细胞迁移实验 A2780/PTX细胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac处理48 h。在24孔板中加入500 μL含体积分数为0.20胎牛血清的DMEM完全培养基，将Transwell小室(孔径8 μm)置于24孔板中，接种5×104个DMEM基本培养基重悬的细胞于小室中，培养48 h。弃小室内的液体，将小室置于体积分数为0.04的多聚甲醛中固定30 min，PBS洗涤3遍；再用结晶紫染色15 min，PBS洗涤3遍。用棉签擦去小室内的细胞，在显微镜下观察迁移到小室底部的细胞数量。

1.2.6划痕实验 A2780/PTX细胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac处理48 h，接种适量未处理和处理后的细胞于12孔板中，待细胞长至90%时，用枪头垂直于孔板底部划一条均匀笔直的划痕，弃原培养基，用PBS洗涤3次，去除划痕时掉落的细胞，加入无血清培养基培养。拍取0、24 h时的照片，观察细胞的迁移情况。

2 结果

2.1不同大豆皂苷对A2780/PTX耐药性的影响在A2780/PTX细胞中分别加入大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac处理后，与A2780/PTX细胞同时测量耐药性。Tab 1结果显示，加入不同大豆皂苷处理后，A2780/PTX的耐药性均有减弱的现象，其中加入大豆皂苷Ac处理的效果最明显，细胞的IC50值明显降低。

**P<0.01vsA2780/PTX

2.2大豆皂苷Ac抑制EMTN-cadherin和E-cadherin是EMT的标志性蛋白，N-cadherin在耐药细胞中高表达，而E-cadherin在耐药细胞中低表达[11]。因此，本研究检测大豆皂苷Ac处理后，A2780/PTX细胞中N-cadherin和E-cadherin的表达情况。蛋白免疫印迹结果(Fig 1A)和激光共聚焦结果(Fig 1B)均显示，经大豆皂苷Ac处理后，A2780/PTX细胞中N-cadherin的表达降低(P<0.01)，E-cadherin的表达升高。证明大豆皂苷Ac能够减弱肿瘤细胞的EMT现象，降低其耐药性。

2.3大豆皂苷抑制肿瘤细胞的迁移能力细胞迁移实验(Fig 2A)和划痕实验(Fig 2B)结果均显示，大豆皂苷Ac处理后，迁移的细胞量减少。证明大豆皂苷Ac能减弱A2780/PTX细胞的迁移能力。

3 讨论

大豆作为现今研究的一个热点，已被证实在肿瘤及多种疾病中发挥重要作用，其活性物质大豆皂苷具有抗氧化、抗凋亡等多种作用[1]。研究表明，大豆皂苷(A1、A2、I)可通过抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介导的PI3K/Akt/NF-κB途径的激活来钝化炎症[12]。也可以通过增强超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，减弱H2O2诱导的ROS，从而抑制肿瘤的发生、发展[13]。Avato等[14]的研究发现，特定结构类型的皂苷具有作为抗癌剂的潜在可能性，来自苜蓿属物种的皂苷可以介导顺铂在肿瘤细胞中的作用。本文首先挑选了4种在大豆中含量较高的常见大豆皂苷，并从中筛选出了逆转A2780/PTX细胞耐药性效果最佳的大豆皂苷Ac。

Fig 1 Soyasaponin Ac affected expression of E-cadherin and N-cadherin of A2780/PTX cells

A2780/PTX cells were treated with 100 mg·L-1of soyasaponin Ac for 48 h, and the expressions of E-cadherin (E-cad) and N-cadherin (N-cad) were detected with Western blot (A) and laser scanning confocal microscopy (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

Fig2SoyasaponinAcaffectedmigrationability

A2780/PTX cells were treated with soyasaponin Ac (100 mg·L-1) for 48 h, cell migration was analyzed with transwell (A) and wound healing assay (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

EMT是上皮细胞呈现间充质特征的过程，在细胞纤维化和癌症进展中起重要作用。 EMT的发生伴随着E-cadherin、Laminin-1、Entactin、MUC-1等蛋白的下调，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin，以及转录因子Snail1、Twist、ZEB等的上调。研究报道，EMT在卵巢癌细胞的转移中起重要作用，EMT由卵巢癌细胞系中的TGF-β、表皮生长因子、肝细胞生长因子和内皮素1诱导产生。同时，EMT与卵巢癌化疗耐药之间也存在密切关系。体外化学疗法可诱导化疗耐药和EMT，并增加卵巢癌细胞的转移能力，靶向抑制或逆转EMT有望成为预防和治疗卵巢癌的良好选择[5,11]。为探索大豆皂苷Ac逆转A2780/PTX耐药性的作用机制，进一步检测了大豆皂苷Ac处理后细胞的EMT现象。本实验蛋白免疫印迹和激光共聚焦发现，大豆皂苷Ac处理后，A2780/PTX细胞中N-cadherin表达降低，E-cadherin表达升高，EMT现象被抑制。同时，Transwell和划痕实验结果显示，A2780/PTX细胞的迁移能力也随之减弱，证实大豆皂苷Ac可以抑制A2780/PTX细胞的EMT现象和迁移能力，降低其耐药性。肿瘤细胞的耐药性已成为肿瘤临床治疗的一大难题，大豆皂苷Ac能逆转A2780/PTX细胞的耐药性这一发现，为卵巢癌的治疗提供了新的思路和方向。