成年大鼠心房成纤维细胞分离与培养方法的建立

任雨洁，佘 刚，侯梦晨，邓秀玲，赵丽梅

(西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理系，陕西西安 710061)

心房结构重塑，尤其是心房纤维化，是房颤持续发生的重要因素。心房纤维化通过持续性阻断心房肌纤维束而导致局部传导紊乱，进而引发房颤。因此，控制心房纤维化可用来预防房颤复发[1]。房颤发生机制的研究涉及到心房成纤维细胞(atrial fibroblasts, AFs)，因此体外培养的AFs是研究心房纤维化机制的关键。但在当前细胞分离技术中，AFs原代培养尚无成熟有效的方法，目前的研究多采用新生乳鼠整个心脏分离培养的成纤维细胞，缺乏心房特异性，且无法真实的反映成年AFs的特性。本研究首次尝试使用成年大鼠心房组织，用混合酶消化法分离培养原代AFs，探索可行的成年大鼠AFs的体外培养方法，以期为相关研究提供更加可靠的体外细胞模型。

1 材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性Sprague-Dawely(SD)大鼠，6周龄(约200 g)，由西安交通大学实验动物中心提供。本研究方案通过西安交通大学医学部伦理委员会的审查并获得批准。

1.2主要试剂及器材胶原酶(Ⅱ型，Gibco)、胰蛋白酶(Sigma)、DMEM(Gibco)、新生胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, Gibco)，兔抗波形蛋白(Vimentin)多克隆抗体、兔抗胶原受体2蛋白(DDR2)多克隆抗体、兔抗vWF、兔抗α-SMA均购自北京博奥森生物技术有限公司，Cy3(3H-吲哚菁类染料)标记的山羊抗兔IgG(西安壮志生物科技有限公司)；二氧化碳恒温培养箱(日本Sanyo公司)、医用净化工作台(北京半导管仪器厂)、低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、倒置相差显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)、全自动倒置显微镜(日本Nikon公司)。

1.3方法

1.3.1心房消化液的配制 取0.048 g胰蛋白酶和0.024 g胶原Ⅱ型酶溶于60 mL PBS溶液中，混匀，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃保存。心房消化液终质量浓度为胰蛋白酶0.8 g/L和胶原酶Ⅱ 0.4 g/L。

1.3.2AFs的分离及培养 将成年SD大鼠用0.1 g/L水合氯醛(30 μL/kg)麻醉，0.3 g/L肝素腹腔注射(2 mL/kg)。麻醉后大鼠仰置于预先紫外线消毒的密闭工作台上，固定动物四肢，使用无菌器械快速取出心脏，放入4 ℃预冷PBS溶液中，转移至超净工作台内。用眼科镊夹取心尖部位，仔细沿冠状窦和右冠状动脉沟剪下左右心房，再夹取上腔静脉，用眼科剪小心依次剔剪左右心耳与心房肌，去除左右肺静脉和主动脉。将心房肌组织剪成数块，用4 ℃无菌PBS冲洗表面血液。用眼科剪将心房肌剪成约1 mm3的小块，4 ℃无菌PBS冲洗2～3次。弃去冲洗液，将心肌转移至15 mL离心管内，加入预温的混合酶消化液2 mL，于37 ℃恒温水浴箱内消化。首次消化约5 min，见消化液浑浊呈乳白色后弃去所得细胞悬液(含大量血细胞)，加入新的消化液2 mL继续消化约5 min(视消化程度而定)。在消化开始和结束时用吸管轻轻吹打瓶中液体。吸取管中上层细胞悬液，移入盛有约3 mL DMEM培养液(含10 mL/L FBS)的离心管中，置于4 ℃冰箱待用。重复以上步骤共7～8次，消化至组织基本消失为止。取暂存于4 ℃冰箱的收集细胞悬液的离心管，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL含20 mL/L FBS的DMEM重悬细胞，以3.0×104/cm2的密度接种于培养瓶中，50 mL/L CO2、37 ℃恒温培养箱培养。将细胞在培养箱内培养70 min，弃掉培养液，再加入含20 mL/L FBS的DMEM培养液，培养至次融合状态后用0.25 g/L胰酶(含有0.02 g/mL EDTA)消化，1∶2传代。采用2～3代AFs进行鉴定。

1.4AFs形态观察与鉴定

1.4.1形态学观察 在倒置显微镜下观察酶消化分离时、差速贴壁70 min后及细胞传代前后的细胞数量、形态及生长情况等。

1.4.2鉴定 取2～3代的AFs以1×105个/孔接种于24孔板中，放入37 ℃含50 mL/L CO2培养箱内进行细胞培养，待细胞生长至70%～80%融合时，进行免疫细胞荧光染色。一抗为兔抗Vimentin多克隆抗体(1∶300)、兔抗DDR-2多克隆抗体(1∶300)、兔抗vWF(1∶300)、兔抗α-SMA(1∶300)，以PBS作为阴性对照；二抗为Cy3标记的山羊抗兔IgG(1∶300)；DAPI(1∶100)进行细胞核染色，900 mL/L甘油封片，荧光倒置显微镜观察。

2 结 果

2.1AFs生长观察刚消化分离下来的细胞呈亮球形，轮廓清晰，单个散在分布或聚集成细胞团。差速贴壁70 min后即有大量细胞贴壁，其中部分已开始伸展，表现为轮廓渐模糊(图1A)；1～2 d后大多数贴壁细胞已伸展成短梭形，并散在生长(图1B)；3～4 d细胞呈细长梭形或多角形，胞核清晰，可见大量的分裂相细胞，除贴壁的细胞团外，一般不形成集落(图1C)；5～6 d可形成细胞单层，漩涡状或纵横状排列，贴壁的细胞团呈放射状生长，细胞接近于次融合状态下进行传代(图1D)。传代细胞贴壁及伸展速度更快，多数细胞在60 min即开始伸展。在约3.0×104/cm2的接种密度及10 mL/L FBS培养条件下，1～2 d即可基本长成细胞单层(图1E)。随传代次数的增加，细胞生长开始变慢，并出现一些体积较大，扁平伸展的多突纺锤形细胞或星形细胞，逐渐失去梭形形态(图1F)。

图1原代及传代培养的成年大鼠AFs形态

Fig.1 The morphology of primary andsubcultured atrial cardiac fibroblasts from adult rats (×200)

A：差速贴壁后70 min；B：差速贴壁后24 h；C：差速贴壁后72 h；D：原代培养6 d；E：首次传代后48 h；F：第5次传代后72 h。

2.2AFs纯度的鉴定经免疫荧光细胞化学技术检测，体外培养的3代成年大鼠AFs Vimentin和DDR2表达均为阳性，而anti-vWF及anti-α-SMA染色呈阴性(图2)，说明此方法分离培养的细胞为AFs，其纯度为98%以上。

3 讨 论

目前，AFs的离体培养主要有两种方法：酶消化法及组织块贴壁培养法。组织块贴壁培养法多用于人AFs的分离[2-3]，主要是因为人心房组织取材不易，较为珍贵，且组织比较娇嫩，不能承受酶液的消化。虽然也有研究者采用组织块贴壁培养法来培养大鼠心室成纤维细胞，但存在组织需求量大、原代培养时间长、易污染等弊处。相对心室组织，大鼠心房组织量小，所需动物成本高，故不宜采用组织块贴壁法。酶消化法的原理是利用消化酶将细胞周边的细胞间质包括基质、纤维等消化去除，使细胞分散，利于分离培养。消化组织细胞常用的胰蛋白酶主要是分解细胞间质的蛋白质，作用较强，对细胞膜有较强的破坏力，分离细胞时容易造成细胞损伤。胶原酶相对作用缓和，可以消化细胞间质中的胶原纤维[4]。心脏组织中有大量的胶原蛋白，故消化心肌组织内的细胞多采用胰蛋白酶和胶原酶的混合酶液。目前的酶消化法所取组织来源均为大鼠、犬等动物心肌组织[6]。研究表明，不同种属和不同发育阶段的心脏成纤维细胞其表型不尽相同[7]，对刺激因素的感受性也就有所差异，因此，有必要针对不同种属的研究对象选择同一种属的细胞模型，以尽可能地模拟体内的情况。目前，大量体外疾病模型的建立采用成年大鼠，而对AFs的研究，由于受细胞分离培养方法的限制，多数研究人员采用乳鼠全心脏进行消化分离培养成纤维细胞[7-8]。新生乳鼠心脏体积过小，分离AFs可行性甚小，也未见相关报道,并且整颗乳鼠心脏分离提取出的成纤维细胞，绝大多数为心室成纤维细胞(CFs)，CFs多用于室性心律失常机制的研究[9]，而研究房颤发生的结构基础—AFs应均为心房来源。房颤虽为最常见的心律失常之一，但在健康人群中的发生率并不高，主要见于器质性心脏病患者，随着年龄的增长，房颤发生率逐渐增加，为年龄依赖性疾病[10-11]、非幼龄疾病，故采用乳鼠分离AFs并不合适[8,10]。

近几年，虽有学者采用原代培养大鼠AFs[11-12]，但提取方法多样，并无报道统一的具体实验方法。本文具体阐述AFs提取及纯化步骤，旨在建立成熟稳定的大鼠AFs分离方法，为后续模型大鼠AFs分离提供了技术基础，以便于离体研究与在体研究统一。

心脏成纤维细胞是细长梭形细胞，其中有椭圆形细胞核[13]。成纤维细胞内含有便于鉴定的特异性蛋白质，即中间丝内的Vimentin及更加具有特异性的DDR2[14-15]，后者在心肌细胞或心脏内皮细胞中不存在[16]。在出生后的健康心脏中，心脏间质中成纤维细胞不表达α-SMA，而在心脏纤维化相关疾病进程中，α-SMA的表达被认为是成纤维细胞激活、分化为肌成纤维细胞的标志[14]，后者具有收缩能力、更强的迁移、胶原合成及分泌等细胞功能，可诱发细胞外基质重构，在心肌纤维化及心肌重塑的病理生理过程中发挥关键作用[17-18]。本研究中，对培养的成年大鼠AFs 3代细胞鉴定为成纤维细胞，其纯度达98%左右。已有研究证明，在普通DMEM/F12培养液中添加TGF-β1，成纤维细胞能够更为稳定地分化为肌成纤维细胞[19]，并且普通培养液培养的低密度成纤维细胞可以自主地转化为肌成纤维细胞，其主要原因是在低密度条件下，细胞之间不能相互接触，为成纤维细胞转化过程中提供了更多的 TGF-β1受体[20]，为细胞分化为肌成纤维细胞创造了有利条件。本研究中观察到，随着传代次数的增加，细胞生长开始变得缓慢且出现扁平伸展的多突纺锤形细胞或星形细胞，分析原因可能为细胞多次传代生长过程中，细胞存活数量减少、低密度培养及多次的细胞分裂引起的表型变化，使细胞失去成纤维细胞的形态及生长等部分特性，转变为肌成纤维细胞[12]。因此，在此基础上的研究不能反映在体AFs的真实状态，故不建议采用4代之后的AFs进行相关研究，且每次接种密度不宜过小，以3×104/cm2的密度较为合适。

图2免疫荧光法鉴定AFs

Fig.2 Identification of AFs by immunofluorescence (×100)