针灸对实验性糖尿病小鼠心脏功能调节的影响

郑晓燕，唐纯志

(广州中医药大学，广东广州 510006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)，是由糖尿病引发的一种广泛性局灶性心肌坏死，具有病情发展快、致死率高的特点。心血管并发症是1型糖尿病患者发病和死亡的主要原因[1]，其中DCM是糖尿病患者引起心衰的主要原因，主要表现为心肌收缩功能下降[2]。目前，国内外针对DCM尚无有效的治疗方法，对其复杂的病理生理机制探讨甚少。针灸疗法是中医治法中一个重要组成部分。文献报道针灸治疗糖尿病及其并发症具有整体调节、降低血糖的作用。肖凤英等[3]采用超声心动图评价电针内关穴治疗DCM，提示电针内关穴明显改善大鼠心功能；祝恩智等[4]报道电针肢体腧穴可减轻2型糖尿病大鼠心脏自主神经纤维损害程度；曹少鸣等[5]将42例非胰岛素依赖型糖尿病患者随机分为针刺组、艾灸组、针刺加艾灸组进行比较研究，结果表明针加灸组的疗效最佳；另有研究表明，电针足三里或艾灸足三里可以降低糖尿病大鼠血糖水平[6-7]。但关于电针或艾灸足三里对糖尿病小鼠心肌病的影响鲜见报道。本研究拟通过建立实验性糖尿病小鼠模型，利用超声心动图在体监测，探讨电针及艾灸对糖尿病小鼠心脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组8～9周龄的雄性C57BL6/J小鼠，购自广州中医药大学动物中心(合格证批号：44007200041981)，饲养于室温(24±1)℃、相对湿度(45±5)%、日光灯照射12 h明暗交替的标准动物实验室，自由饮水。适应性喂养72 h后按照随机数字表法分为空白对照组、糖尿病组、电针干预组、艾灸干预组，每组12只。实验过程中对动物的处理均符合科技部颁布的“关于善待实验动物的指导性意见”。

1.2主要试剂和仪器链脲佐菌素(STZ, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)；小动物超声40 MHz传感器Vevo 2100系统(VisualSonics, Toronto, Canada)；Master-8可编程刺激器(以色列/AMPI)；针灸针(EL452, Biopac Systems, Goleta, CA)；动物实验用艾灸；血糖检测试纸试剂盒(爱科来arkray)、京都血糖仪GT19(20型)；瑞沃德麻醉机；转棒(滚筒/疲劳)实验分析系统(上海吉量科技)。

1.3造模方法以70只雄性8～9周龄的雄性C57BL6/J小鼠为研究对象,随机抽取12只为空白组，其余以大剂量STZ腹腔注射制备1型糖尿病小鼠模型。腹腔注射STZ 3周后，使用血糖检测试剂盒测量空腹血糖>11.1 mmoL/L时，1型糖尿病模型成功[8]。成模小鼠38只随机分为糖尿病组、电针干预组、艾灸干预组，每组12～14只。STZ溶解于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲溶液(pH 4.5)，剂量为50 mg/kg[9]。空白对照组注射等效体积的柠檬酸盐缓冲溶液。动物在STZ给药前禁食过夜12 h。给药后自由用水和食物。

1.4各组的处理方法参照文献[10]穴位定位，足三里ST36穴位位于小鼠胫骨前肌胫骨前结节外侧2 mm，膝关节下端4 mm。

电针干预组：电针时用瑞沃德麻醉机气麻。电针参数参考文献[11]，选用12 mm针灸针在足三里穴进针深度约3 mm，用master8电针仪电刺，进行连续模式刺激15 min，电位差为4 V，电流为40 mA，脉冲宽度为50 μs。两电极加于两侧下肢足三里穴。每日1次，每周治疗5 d，共8周。

艾灸干预组：艾灸时使用气体麻醉。取双侧“足三里”，采用动物实验专用细艾条点燃后在穴位处施灸，距离穴位表面2～2.5 cm，用表面温度计测量，穴位体表温度40～46 ℃。每次各灸15 min。每周治疗5 d，共8周。

空白对照组与糖尿病组常规饲养。

1.5观察指标及检测方法小鼠超声心动图的检查：各组治疗8周后检测超声心动图。根据美国超声心动图协会的检测方法[12]，分别对各组小鼠行超声心动图B-Mode及M-mode检测。以15～20 mL/L异氟醚吸入剂与1 L/min 100 mL/L O2混合，麻醉小鼠，以维持整个手术中的轻度镇静水平。将小鼠固定在加热平台腹侧，保持体温在(37±0.5)℃。ECG电极连续监测心率(HR)和呼吸生理。将小鼠胸部剃光并加热，将超声波凝胶应用于感兴趣的区域。使用Vevo 2100系统进行胸腔超声心动图检测。从左心室短轴方向在M型视角下测量左心室LV前壁(LVAW)、LV后壁(LVPW)和LV内径(LVID)的厚度。M型短轴视图测量的LV结构参数用于计算LV分数缩短(FS)。整个实验过程由经过专业培训的固定人员按照标准操作规程实施。

滚轴实验：参照文献[13]的方法，在造模后11周测量小鼠在棒上的步行时间，观察小鼠的运动和肌肉协调能力。训练阶段小鼠在以4 r/min旋转速度在水平棒上行走。训练阶段持续了3 d，每天3次，每次5 min。在第4天，旋转速率以每40秒增加4 r/min的加速度，直到达到40 r/min的最大速度。记录各组动物坠落潜伏期,观察小鼠运动情况。

1.6统计学分析应用SPSS 20.0统计软件包进行统计学处理。数据以均数±标准差表示。组间差异比较采用单因素方差分析，继以LSD-t检验比较两两之间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1一般状态观察实验过程中，空白组小鼠精神状态良好，反应灵敏，动作自如，毛发平伏有光泽，无死亡。糖尿病组小鼠腹腔注射STZ 3周后开始逐渐出现多饮、多食、多尿症状，精神萎靡、少动、易惊、反应迟钝、动作迟缓，病程中死亡率达15%，3只小鼠出现脚趾皮肤皮损，饲养的鼠笼垫料有红色腥臭分泌物。电针干预组精神状态稍差，毛色无光泽较正常组差，但比糖尿病组好，大便量较正常组偏多，无死亡。艾灸干预组小鼠性情比较急躁，出现笼间打架的现象，无死亡。

小鼠糖尿病造模成功后，空腹血糖均在11 mmoL/L以上，表1为电针和艾灸治疗前后空腹体质量和血糖浓度的比较。与空白组相比，糖尿病组空腹体质量下降、血糖浓度明显升高(P<0.05)，而电针干预组和艾灸干预组空腹体质量和血糖浓度无明显变化(P>0.05)。说明针灸对糖尿病小鼠的体质量具有较好的调整作用，电针和艾灸干预可以改善STZ所引起的体质量降低。

表1各组小鼠治疗前后空腹体质量和血糖比较

Tab.1 Comparison of fasting weight and glucose level in mice of each group

组别治疗前例数体质量(g)血糖(mmoL/L)治疗后例数体质量(g)血糖(mmoL/L)空白组1226±1.57.56±1.501229±3.28.37±1.88糖尿病组1425±1.320.23±1.301219±4.8*25.93±1.60*电针干预组1224±1.821.73±2.191221±8.114.34±1.39艾灸干预组1225±1.319.28±1.231222±7.416.98±1.70

与空白组比较，*P<0.05。

2.2各组小鼠超声心动图左心室收缩功能的比较4组小鼠均取得清晰的左室短轴切面M型视图，在此切面上可以看出糖尿病M型曲线收缩期内径增大(图1A)。图1B为4组小鼠左室短轴切面M型视图收缩期左心室内径(LVIDs)。4组小鼠在第11周末彩色超声心动图短轴收缩期的内径显著不同，糖尿病组收缩期内径显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，而电针干预组和艾灸干预组内径与空白组相比无统计学差异(P>0.05)。图1C所示为M型超声心动图检测小鼠左心室收缩功能指标左室短轴缩短率[LVFS=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100%]。4组小鼠在第11周末彩色超声心动图短轴缩短率不同，糖尿病组短轴缩短率显著低于空白组，有统计学差异(P<0.05)，而电针干预组和艾灸干预组短轴缩短率与空白组相比无统计学差异(P>0.05)。进一步分析表明，4组小鼠分别于造模8周后行超声心动图检查，注射STZ 11周后小鼠左心室收缩末期内径增大，左心室短轴缩短率降。糖尿病组与空白组比较提示，糖尿病小鼠在造模8周后出现左心室收缩功能障碍。经电针和艾灸治疗后，左心室收缩末期内径和左心室短轴缩短率均无差异，说明电针和艾灸均能改善由STZ所诱导的实验性小鼠心脏收缩功能障碍，两种干预手段的治疗效果相当。

2.3滚轴实验结果利用滚轴实验测量小鼠11周末的运动体力与肌肉协调能力，结果显示，糖尿病组的小鼠坠落潜伏期比空白组短，有统计学差异(P<0.05)，提示糖尿病小鼠在后期可能会出现运动不协调与运动耐力下降。电针干预组坠落潜伏期和艾灸干预组坠落潜伏期与空白组相比无统计学差异(P>0.05，图2)。

3 讨 论

中医对糖尿病的认识及针灸治则思路，从经络的循行、生理、病理及穴位的选取等方面来讲，使用频次较高的穴位依次是足三里、三阴交、脾俞、肺俞、肾俞[14]。糖尿病心肌病在古代中医古籍中的记载多被认为是消渴病的并发症，并有其详细的穴位外治法。《针灸甲乙经·五气溢发消渴黄瘅 第六》云：“消渴身热，面目赤黄，意舍主之；消渴嗜饮，承浆主之；嗜卧，四肢不欲动摇，腕骨主之；消瘴善，气走喉咽而不能言，大便难，唾血，口中热，唾如胶，太溪主之；阴气不足，热中，消谷善饥……足三里主之”。

本实验小鼠经腹腔一次性注射STZ，第3周空腹尾血糖>11.1 mmoL/L为造模成功，模型成功率65%。STZ注射后11周经彩色超声心动图检测，与空白组相比，糖尿病组小鼠左心室短轴缩短率明显下降，出现左心室收缩功能障碍。从国内外学者文献报道中得知，糖尿病心肌超微结构的病变始于4～6周左右[9-10]。本研究在第11周检测出糖尿病小鼠左心室收缩功能障碍，与上述文献相符合。

图1各组小鼠超声心动图左心室收缩功能的比较

Fig.1 Comparison of left ventricular systolic function in echocardiography of mice in each group

A：超声心动图M型界面下心脏左心室短轴左心室舒张末期内径(LVIDd)收缩末期内径(LVIDs)；B：4组小鼠超声心动图M型界面下左心室短轴收缩末期的内径(LVIDs)；C：M型超声心动图检测小鼠左心室收缩功能指标左室短轴缩短率(FS%)，n=12。*P<0.05。

图2四组小鼠滚轴实验坠落潜伏期差值的比较

Fig.2 Comparison of the difference between the fall latency in the experiment of four groups of mice

*P<0.05。

HAMBLIN等[15]在STZ诱导的糖尿病大鼠中也观察到8周后心脏收缩功能出现障碍。经电针和艾灸治疗8周，与空白组相比较，电针干预组和艾灸干预组的左心室短轴缩短率无统计学差异，提示电针及艾灸可能改善了糖尿病小鼠心脏收缩功能障碍。STZ注射后8周，与空白组相比，糖尿病组小鼠滚轴实验坠落潜伏期明显下降，运动能力变差。而电针和艾灸治疗后小鼠坠落潜伏期与空白组无明显差异，提示电针和艾灸可能改善由STZ所诱导的运动能力变差。

近年来，对针灸治疗糖尿病的机制研究有了一定的进展，但随着现代医学对糖尿病研究的深入，又提出了新的机制。DA等[16]认为，糖尿病性心肌病与1型糖尿病(T1DM)患者的心脏重塑、心肌功能障碍、低度炎症和心脏脂联素水平降低有关。另外，NIEMANN等[17]发现，糖尿病、肥胖、吸烟和过度污染是发生心脏疾病的危险因素。糖尿病或肥胖患者心脏疾病的发病率更高，即使是最佳的药物治疗，心脏线粒体和其他来源的活性氧(ROS)释放增加也可能导致心功能不全。本研究提示电针或艾灸足三里穴均可以改善实验性糖尿病小鼠的心功能，但两者的治疗效果相当。推测当心肌处于收缩功能下降状态时，电针小鼠双侧阳明经穴区在提高心脏收缩性能时可能改善了相关经穴穴区的能量代谢和气血功能活动。电针足三里极有可能是通过改善心肌的线粒体功能来提高心肌的收缩功能。

综上所述，由STZ所诱导的心脏收缩功能障碍，电针和艾灸干预治疗后心功能和运动功能存在一定的特征性变化。在心肌高糖损伤状态下，左心室短轴缩短率显著降低，电针或艾灸治疗后，左心室短轴缩短率显著升高；而在运动功能方面，心肌高糖状态下，滚轴实验坠落潜伏期较空白组明显下降，在注射STZ后11周，小鼠出现运动不协调性现象，实验性糖尿病模型心功能可能与运动功能有一定的特异性联系,其相关机制需进一步探讨。