猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

陈小金，张 霞，王玉玲，董志珍

（天津海关动植物与食品检测中心，天津 300456）

腹泻是影响猪群生产的一种常见的多发性疾病。引起腹泻的病原多而复杂，其中猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒是目前常见仔猪腹泻病毒性病原[1-2]。2013年张志等[3]对我国5省份的部分规模猪场开展研究，发现猪场的腹泻流行率达71.99%。2014年美国23个州暴发了2 692起腹泻疫情。其他国家，如德国、法国、瑞士、意大利、韩国、泰国和越南等，也在近几年相继暴发过腹泻疫情，造成了严重经济损失[4-5]。由此可见，腹泻已成为影响世界养猪业发展的主要疾病之一。而变异毒株和新型病毒的出现更增加了其防控难度。因而，引起腹泻的相关病毒备受关注，

2014年美国俄亥俄州猪场发生腹泻疫情，临床症状与流行性腹泻相似。调查发现，引起该疫情的病原并非猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PRoV）和沙门氏菌，经电镜检测最终确定病原为PDCoV[6]。明尼苏达大学兽医诊断实验室和爱荷华州立大学提交两株PDCoV全基因组序列，检测发现其与Patrick等报道的PDCoV HKU15-155和HKU15-44毒株序列高度同源[7-9]。2014年4—6月韩国学者从腹泻猪场样本中检出PDCoV，并发现其与我国香港毒株和美国毒株的同源性分别为98.8%～99.0%和99.6%～99.8%[10]。Marthaler等[9]对美国部分地区2014年1—2月的猪场样品进行检测，发现PDCoV阳性率为30%，表明PDCoV在美国中东部地区普遍存在；此外，约22%样品是PDCoV单独感染，58%样品为混合感染，其中和PRoV混合感染的比例最大。Ma等[11]对PDCoV Ohio CVM1毒株进行研究，证实PDCoV可以引起仔猪腹泻、呕吐、脱水等类似猪传染性胃肠炎和流行腹泻的临床症状，同时发现PDCoV能够引起明显的胃部病变以及轻度肺部病变。

目前针对PDCoV检测方法的研究相对较少。少量文献报道已有研究人员建立了RT-PCR、探针法荧光PCR、ELISA检测方法[9，12-18]。SYBR Green I 荧光PCR具有操作简便、成本低等优点，可广泛应用于基层实验室。本研究以染料法为基础，建立针对PDCoV的SYBR Green I的荧光定量PCR方法，旨在丰富PDCoV检测技术体系，为进出境活猪病毒性腹泻疫病检测以及防控与预警提供技术手段，为防止外来重要动物疫病传入提供保障，同时为疫苗的评价，以及病原体在动物机体内的动态分布、细胞培养中的病毒滴度等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞系及临床病料

试验中使用的病毒株均为疫苗毒，包括猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。待检样品为2017年收集的国内部分省份猪场腹泻粪便及2017年本实验室收集的进境种猪粪便拭子（源自加拿大和美国）。

1.2 主要试剂及仪器

随机引物：购于Promega公司；pUC19、Premix ExTaq、SYBR Green I荧光PCR预混液、载体、Easy dilution buffer：购自大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂盒、Rayscript cDNA Synthesis试剂盒：购自上海捷瑞生物技术有限公司；Axygen DNA Gel Extraction Kit：购自Axygen公司。

旋涡震荡器QL-861：购自江苏省海门市麒麟医用仪器厂；洁净工作台SW-CJ-2D：购自苏州净化设备有限公司；台式高速冷冻离心机Neofuge13R：购自上海力申科学仪器有限公司；普通PCR仪：购自北京东胜创新生物科技有限公司；金属恒温连接仪：购自Eppendorf公司；移液器：购自德国Eppendorf公司；NanoDrop 5000：购自美国Thermo；电泳仪Mini Pro 300 V：购自美国Power supply major science公司；电泳槽Labnet Sub System 70：购自美国Labnet公司；Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪：购自德国QIAGEN公司。

1.3 引物设计与合成

参照GenBank登录的PDCoV基因序列，对不同毒株基因进行序列比对，筛选M基因保守区域，并以其为靶基因设计2对特异性引物，预期扩增目的片段长度分别为235和108 bp。上述引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成，特异性引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 模板制备及病毒核酸的提取和反转录

取500 mg阳性粪便样品加入500 μL灭菌生理盐水，以5 000 r/min的转速4 ℃离心30 min，弃沉淀保留上清。取100 μL上清，加入200 μL RnaExTM试剂，漩涡震荡器上振荡混匀破碎细胞5～20 s（2～3次），加入500 μL RnaExTM试剂，颠倒混匀，室温裂解5 min。加入0.2 mL氯仿，漩涡振荡，室温静置2 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。取400 μL上清加入到无菌无RNA酶的1.5 mL EP管中，按2：1的比例加入200 μL无水乙醇，充分混匀，然后将上述溶液全部转移到套放于2 mL收集管内的吸附柱中。8 000 r/min 4 ℃离心1 min，除去收集管中的废液。加入500 μL Buffer RWA，12 000 r/min 4 ℃离心1 min，除去收集管中的废液。重复用Buffer RWA洗1次。12 000 r/min 4 ℃离心1 min，除去收集管，将柱子放入无菌无酶的1.5 mL离心管中，晾干2 min，在柱内膜的中央小心加入50 μL DEPC水溶解RNA，室温2 min。12 000 r/min 4 ℃离心1 min，收集RNA置于-70 ℃保存。

以上述方法提取的RNA为模板，用Rayscript cDNA Synthesis KIT进行反转录，合成cDNA，于-20 ℃保存备用。反应体系30 μL：Random primer 1.0 μL、随机引物 1.0 μL、5×RT Buffer 6.0 μL、dNTP 1.0 μL、Rnase Inhibitor 1.0 μL、M-MLV反转录酶1.0 μL、RNA 12.0 μL，用H2O补至30 μL。反应程序为：37 ℃ 1 h，85 ℃ 5 min。

1.5 标准品鉴定和制备

以cDNA板进行PCR反应，反应体系为25 μL，具体如下：2×Premix Ex Taq缓冲液12.5 μL，MF和MR各（10 pmoL/mL）1.0 μL，cDNA模板2 μL，最后用灭菌去离子水补至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物用Axygen DNA Gel Extraction Kit回收，将目的片段克隆到 pUC19载体，并转化大肠杆菌DH5-α中。摇菌筛选阳性克隆，提取质粒，并对重组阳性质粒PCR鉴定、测序，筛选基因序列正确的质粒作为标准品。用紫外分光光度计检测质粒浓度，根据公式换算质粒浓度到copies/µL，-20 ℃保存备用。

1.6 荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线建立

通过对荧光定量PCR反应体系中的引物浓度和反应条件等进行筛选和优化，最终确定的反应体系为：RE-F和RE-R（10 pmol/mL）各0.8 μL，模板1.0 μL，SYBR Green I 反应液10.0 μL，灭菌去离子水补充至总体积20 μL；最佳反应条件为95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，59 ℃ 30 s，40个循环。用Easy dilution buffer将质粒pUC19-M进行10倍梯度稀释以制备标准品，以不同浓度标准品为模板，在Rotor Gene荧光定量PCR仪上进行检测，获得扩增动力学曲线，并依此绘制标准曲线。

1.7 实时荧光定量PCR评价

1.7.1 特异性试验 本试验以几种常见猪病疫苗毒为参照进行特异性试验。分别提取PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV的RNA，以最佳反应体系和最佳反应条件，在Rotor Gene荧光定量PCR仪上进行操作，试验中同时设立阴性和阳性对照。

1.7.2 敏感性试验 梯度稀释已知浓度的重组质粒（2.49×108～2.49×100copies/μL），吸取1.0 μL不同浓度质粒作为模板，进行Real-time PCR，得出本研究所建立的检测方法所能检出的最低拷贝数。同时取上述相同体积质粒作为模板进行常规PCR，以比较两种方法的敏感性。

1.7.3 重复性试验 选取3个已知浓度标准品（2.49×106、2.49×104、2.49×102）作为批间和批内重复试验的模板进行Real-time PCR，对试验数据进行统计学分析。上述3个浓度标准品分别设立3个重复，在同一反应条件下同时检测，通过分析试验所得的Ct值进而计算批内变异系数；将上述3个浓度标准品置-20 ℃保存，每次间隔1周连续检测3次，通过分析试验所得的Ct值计算批间变异系数。

1.8 临床样品检测

将2017年收集的62份粪便样品及1 168份进境种猪粪便拭子，按照1.4所述方法提取RNA并反转录成cDNA，以最佳反应体系和反应条件进行Realtime PCR检测，同时以上述样品的cDNA作为模板进行常规PCR检测，对比两种方法的检测结果。

2 结果

2.1 目的片段扩增

以设计的RE-F、RE-R特异性引物进行PCR扩增，获得大小为108 bp的目的片段。测序结果显示，试验扩增的目的片段与亲本PDCoV基因序列的一致性为100%（图1）。以MF和MR扩增获得的M基因（扩增长度为235 bp，图1），用于与载体pUC19连接构建重组质粒，并作为标准品。

图1 PDCoV引物特异性的PCR 鉴定

2.2 标准曲线建立

提取阳性重组质粒，并用紫外分光光度计测得质粒DNA的浓度为527 ng/μL，经过计算得出其拷贝数为2.49×109copies/μL，对该质粒进行10倍梯度稀释，选择2.49×108～2.49×102copies/μL的质粒作为标准品。

图2 标准品的动力学曲线

将质粒标准品按照最佳反应条件进行Realtime PCR反应，发现质粒浓度在2.49×108～2.49×102copies/μL之间呈现良好的线性关系。扩增曲线（图2）分析表明，曲线1、2、3、4、5、6、7分别为模板浓度是2.49×108、2.49×107、2.49×106、2.49×105、2.49×104、2.49×103、2.49×102copies/µL的质粒标准品动力学曲线；质粒标准品从2.0×108～2.0×102copies/μL的Ct值分别为8.31、11.47、14.77、18.18、21.53、24.57、27.00。标准曲线分析表明，斜率为-3.18，x轴截距为35.13，直线方程为y=-3.18x+35.13，相关系数（R2）为0.998，扩增效率为1.06（图3）。

图3 标准曲线

2.3 特异性

采用Real-time PCR检测PEDV、TGEV、PoRV、PRRSV、CSFV不同病毒的RNA，结果均为阴性，其特异性扩增曲线见图4。

图4 特异性试验结果

2.4 重复性

采用Real-time PCR，对2.49×106、2.49×104、2.49×102copies/μL的标准品分别进行批内重复试验及批间重复试验，发现批内变异系数分别为0.99%、0.67%、1.00%，批间变异系数分别为2.85%、1.70%、2.04%（表2）。以上结果显示，3个不同浓度标准品作为模板进行Real-time PCR反应所得Ct值的批间和批内变异系数均小于3%，表明本研究所建立的方法具有很好的稳定性。

表2 PDCoV荧光定量PCR重复性试验数据分析

2.5 敏感性

以2.49×108～2.49×100copies/μL的质粒标准品为模板，对每个浓度1.0 μL进行实时荧光定量PCR和常规PCR。结果显示，Real-time PCR对质粒标准品的检测下限为24.9 copies/μL，而常规PCR的检测下限为2.49×103copies/μL（图5、表3），表明Real-time PCR比常规PCR敏感约100倍。

图5 荧光PCR敏感性

表3 敏感性试验数据分析

2.6 样品检测

检测2017年收集的猪腹泻粪便样品62份，应用Real-time PCR、常规PCR对病料进行检测。结果显示，在62份待检样品中，Real-time PCR检出26份阳性，常规PCR 检出16份阳性（表4）。检测结果表明，本试验建立的实时荧光定量PCR较常规PCR方法的检出率更高。用上述两种方法对2017年源自美国和加拿大的种猪粪便拭子进行检测，发现均为阴性，二者一致性达100%。

表4 样品PDCoV检测结果 单位：份

3 讨论

近期，病毒分类国际委员会提议将冠状病毒分为4个属，即α、β、γ和δ[19]，在PDCoV发现之前，δ冠状病毒成员为鸟类冠状病毒，以哺乳动物为宿主的冠状病毒几乎归属为α、β群。早在2012年，香港大学学者在进行冠状病毒流行病学调查时，就已经发现了该病毒，并将其归为δ冠状病毒[20]，只是当时并未引起重视。2014年美国暴发多起腹泻疫情，经鉴定为PDCoV引起，此时PDCoV才受到广泛关注[5，7-8，11，17，21]。作为仔猪腹泻新病原，PDCoV的出现给全球仔猪病毒性腹泻防控带来了新挑战。因此，世界各国研究人员针对PDCoV开展了一系列研究，包括病毒基因序列分析、蛋白功能研究、病毒分离培养以及动物试验、检测方法建立（ELISA、RT-PCR、探针法荧光PCR）等[9，12-18]。本研究通过对GenBank上登录的PDCoV国内外毒株基因序列分析，选择最保守的M基因为靶基因设计特异性引物，建立了SYBR Green I荧光PCR方法，用于检测该病毒。本实验室检疫的活猪来源于美国和加拿大。而这两个国家都报道发生过PDCoV引起的腹泻疫情，这就更突显了口岸疫情监测的重要性与必要性。

4 结论

本研究将SYBR Green I荧光PCR技术应用于PDCoV检测。评价数据显示，建立的方法具有较好的特异性，呈现典型的扩增曲线，且熔解曲线为单一特异峰（Tm值为82.7 ℃），敏感性可达24.9 copies/μL，批内、批间变异系数均小于3%，表现出较好的重复性。用本研究所建方法和常规PCR同时对62分猪腹泻粪便样品进行检测，发现前者检出率更高；两种方法对1 168份进境活猪粪便拭子的检测符合率为100%。因此，该方法实现了快速、灵敏、特异的检测目的，操作简单且检测成本低，可用于猪场分子流行病学调查及早期诊断，也可用于组织病毒载量研究。该方法的建立为PDCoV致病机理的研究奠定了基础，同时为防止外来重要动物疫病传入提供了技术手段和保障，有助于我国生猪检验检疫体系的进一步完善。