猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

张 志，张丽丽，，刘 爽，单 虎，李晓成，王树双

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 青岛农业大学，山东青岛 266019）

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科，是一种单股非囊膜线性DNA病毒，基因组大小为4～6.3 kb[1]。PPV最早发现于1965年，主要引起母猪不孕不育，以及产死胎或木乃伊胎等繁殖障碍症状，是影响养猪业的重要疫病之一[2]。2016年Palinski等[3]首次从美国健康猪的棉拭子中，通过基因组测序鉴定出一种新的PPV亚型病毒，并将其命名为PPV-7。该病毒的ORF与狐蝠细小病毒2和火鸡细小病毒TP1-2012/HUN 毒株之间的同源性分别为42.4%和37.9%，因此把这3种病毒归为一个新的属Chapparvovirus。

2017年我国Xing等[4]也从2014年保存的广东省2个商品代猪场的猪血清中检测到了PPV-7，表明我国已有PPV-7感染的存在，且至少可以追溯到2014年以前。本实验室在前期工作中用普通PCR方法也鉴定并分离到一株PPV-7病毒。为进一步了解PPV-7在我国猪场的流行状况，本研究以此病毒为参考毒株，构建了PPV-7 Taqman实时荧光PCR方法，并选择我国部分省市的猪场样品进行了实际检测。本方法的建立为开展PPV-7流行病学调查、监测和诊断等提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品来源

96份猪病料：来自福建、山东、河南等省份，表现发热、腹泻、流产等临床症状的发病猪群。

1.2 病毒

PPV-7病毒株SD10：本实验室鉴定和分离；猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪圆环病毒3型（PCV-3）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒1型（PPV-1）：本实验室分离鉴定和保存。

1.3 主要试剂

Real Time Taq 试剂盒（RR390A）、pMD-18T vector和DH5α感受态细胞：宝生物工程（大连）有限公司产品；病毒DNA提取试剂盒（DNAZol）：Life公司产品。

1.4 引物设计

参考PPV-7基因组序列（KU563733）和文献[10]的检测方法，并在其基础上进行改进，设计1对新引物PPV7-F1和PPV7-R1，以及1条荧光探针引物PPV7-P1。序列分别为：

引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.5 样品DNA提取

根据DNAzol说明书，从猪样品中提取总基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.6 阳性标准品制备

以引物PPV7-F1和PPV7-R1为扩增引物，以阳性样品SD10提取的DNA为模板进行PCR扩增；将PCR扩增产物克隆到pMD-18T载体中，再转化至DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选；挑取阳性克隆测序，提取质粒并测定浓度，将此质粒的浓度调整为 15 ng/μL（即 4.6×109copies/μL），作为PPV-7标准品进行相关的荧光PCR试验。

1.7 荧光PCR方法建立

以阳性PPV-7的标准品样品为模板，建立荧光PCR方法。配制的荧光PCR反应体系包括：Premix EX-Taq反应液12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）、下游引物（10 μmol/L）和荧光探针（5 μmol/L）各1 μL，DNA标准品2 μL，用 ddH2O 补充至 25 μL。荧光 PCR 的反应扩增条件为：95 ℃预变性3 min，45个扩增循环（95 ℃5 s、60 ℃14 s），60 ℃读取荧光。

1.8 标准扩增曲线建立和敏感性试验

将浓度为15 ng/μL的PPV-7阳性质粒标准品分别进行10倍倍比稀释，然后以10-2～10-8等7个稀释度为模板，进行荧光定量PCR扩增；将各浓度得到的Ct值为纵坐标，以稀释倍数的负对数为横坐标，制作标准曲线，在此基础上确定荧光PCR的敏感性和最小检测极限。

1.9 特异性试验

用建立的PPV-7荧光PCR方法，同时扩增PCV-2、PCV-3、PRV、PPV-1等提取的DNA模板，观察本方法检测其他病原时的荧光PCR反应结果，评价本方法的特异性。

1.10 重复性试验

将已知浓度的PPV-7阳性标准品分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和 10-8，分别进行组间和组内重复性试验。组内重复性试验时，每个浓度分别用本方法重复检测3次；组间重复性试验时，分别在3个时间，用本方法重复检测3次，最后对检测结果进行统计学分析，评价本方法的重复性。

1.11 实际应用

采用建立的荧光PCR方法，对从临床采集的96份猪样品进行检测，通过扩增的阳性结果，评价本方法在实际生产应用中的可行性。

2 结果与分析

2.1 阳性标准品制备和浓度测定

以PPV-7病毒株SD10提取的DNA为模板，用引物PPV7-F1和PPV7-R1进行扩增，扩增到一条大小为117 bp的特异性条带。该特异性条带与pMD18-T载体连接和转化DH5ɑ感受态细胞后，从板上随机挑选6个白色菌落，提取质粒DNA，再用PCR进行鉴定，发现这6个样品中，有4个可以检测到117 bp大小的目的基因。将其中3条最亮条带对应的质粒样品送去测序，并与PPV-7参考毒株KU563733进行同源性分析，发现这3条带与PPV-7参考毒株的同源性均为100%，表明这3个质粒均含有PPV-7。将这3份质粒混样进行浓度测定，发现为165.48 μg/μL；再用TE缓冲液调整浓度为15 ng/μL，并以此作为PPV-7阳性标准品，命名为PPV7-SD10。同时将质粒pMD18-T空白载体也稀释成15 ng/μL作为阴性标准品。

2.2 荧光PCR方法建立

本研究中，引物和探针的加样体积分别以0.5、1和2 μL加样。另外，反应条件筛选时选择3个指标进行不同组合，变性时间选择了95 ℃ 1 min、2 min、3 min和5 min，退火温度按照55～62 ℃间隔1℃，同时变性时间从10 s到30 s。将这些不同的反应条件组合交叉进行试验，通过多次试验优化后，获得最佳反应体系和最佳反应条件，即每一种引物均加入0.5 μL，反应条件为95 ℃预变性3 min，45 个扩增循环（95 ℃ 5 s、60 ℃ 14 s），60 ℃读取荧光，此时获得的反应结果最好。

2.3 特异性试验

以阳性标准品PPV7-SD10的10-5稀释的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，结果可以扩增出一条特异性的“S”形曲线，同时用建立的荧光探针方法对PCV2、PCV3、PRV和PPV-1等其它DNA病毒进行扩增，结果均没有扩增出特异性条带，表明本方法对PPV-7具有较好的特异性，对其它DNA病毒无扩增交叉反应（图1）。

图1 PPV-7荧光PCR方法的特异性

2.4 标准曲线和敏感性试验

将构建好的PPV7-SD10阳性标准品10倍倍比稀释后的DNA为模板进行荧光PCR扩增，发现随着模板拷贝数的降低，扩增的Ct值逐渐增加，当稀释度达到原模板浓度的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和 10-8时，扩增的 Ct值分别为 12.50、16.65、20.96、25.38、29.38、33.06 和35.01，扩增曲线仍然为一条典型的“S”形曲线，但当稀释倍数递减为10-9时，荧光PCR扩增不出典型的“S”型曲线，表明本方法的检测极限是样品的10-9稀释倍数（图2）。以10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等不同浓度的反对数为横轴，以对应的Ct值为纵轴制作标准曲线（图3），可以得到相关的回归方程：y=4.154 6x+4.292 8，相关系数R2=0.999 2，说明Ct值与拷贝数之间呈现非常强的线性关系，表明本方法稳定性好。对不同浓度的模板使用本方法进行检测，均可以得到较好的试验结果。

图2 荧光探针方法的敏感性试验结果

图3 荧光探针方法的标准曲线

2.5 重复性试验

用上述稀释倍数为 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的标准品为模板DNA，进行组间和组内重复性试验，重复3次后进行统计分析，发现3次重复的变异系数（CV）均小于2%，表明本方法的重复性较好（表1、图4）。

表1 不同浓度模板进行PPV-7荧光PCR重复性的变异结果

2.6 实际应用

用建立的荧光方法，对 96份猪样品进行检测，发现有52份样品扩增出典型的“S”型曲线（图5），与阳性样品结果一致，阳性率为54.2%，表明本方法是可行的，可用于PPV-7的流行病学调查和监测。

3 讨论

图4 荧光PCR方法的重复性试验结果

图5 荧光探针PCR检测临床样品PPV-7的结果

PPV在猪群中普遍存在，是猪群常见的多发性疫病[5]。最近几年，随着检测技术的发展，除发现了经典的猪细小病毒（PPV-1）以外，还陆续发现了PPV2—PPV7等不同的亚型[6-9]，因此建立这些PPV亚型的快速、准确、方便的检测方法具有重要意义。

尽管病原检测有PCR、纳米PCR、SYBR Green荧光PCR等方法[10-12]，但基于Taqman探针的实时荧光PCR方法仍然是检测病原最常用的方法。它具有特异性强、敏感性高的特征，在病原检测领域广为应用。猪瘟、口蹄疫等一大批动物疫病病原检测都已建立了实时荧光PCR技术[13-14]。本研究建立的PPV-7荧光PCR方法的最低检测极限是45个病毒拷贝/μL，显示出极高的检测敏感性。这一检测极限与孙文超等[12]建立的SYBR Green荧光PCR方法能检测出50个病毒拷贝/μL的检测极限基本一致。另外，本研究建立的荧光PCR方法也表现出良好的特异性，完全可以与经典PPV-1和其他猪病病原区别开，从而为PPV-7的流行病学调查和监测提供了有效技术支撑。

在临床病料的实际应用中，本方法也表现出了较好的效果，从96份病料中检测出52份阳性病料，阳性检出率达54.2%。这一结果虽然比孙文超等[12]检出的71.88%略低，但高于Xing等[4]在猪血清中检出的32.8%。这些结果表明我国猪群的PPV-7感染状况较为严重。另外本研究采集的阳性病料来自山东、江西、广西等省份，可以看出PPV-7在我国猪群中流行较为广泛，须引起重视。但是，本研究仅仅是针对送检病料进行了被动监测，其检测结果的代表性不够全面，还需要开展更系统的流行病学调查和主动监测，进一步摸清PPV-7在我国猪群的感染和流行规律。

作为2016年新鉴定和检测到的一种血清型，PPV-7仍存在致病机制不清、流行规律不明，检测方法匮乏等诸多需要解决的问题。本文建立的实时荧光PCR方法有助于PPV-7的早期诊断和发现，对于该病原的监视和流行趋势判断都有重要意义。

4 结论

本研究以PPV-7全基因组为模板，设计合成引物和Taqman探针，建立了PPV-7 Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法对PPV-7具有较好的特异性，对其它DNA病毒无扩增交叉反应；其最低检测极限为45个病毒拷贝/μL，具有极高的检测敏感性；3次重复试验的变异系数（CV）均小于2%，重复性较好。因此，本方法可用于PPV-7的流行病学调查和监测，对于该病原的监视和流行趋势判断具有重要的技术支撑意义。