一例猪伪狂犬病野毒感染的实验室诊断

黎 露，韩涛涛，吴思雯，唐青海，杨 海，何丽芳，刘 最，王芳宇，张 倩

（衡阳师范学院生命科学与环境学院生物技术重点实验室，湖南衡阳 421008）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的多种家畜的急性传染病，1周龄内仔猪易感，多出现发热、奇痒、昏睡、共济失调等神经症状，妊娠母猪后期感染可发生流产，产死胎，甚至木乃伊胎[1]。以往，育肥猪感染一般不发生死亡，仅出现增重减慢、体温升高等轻微症状[2-3]。近年来，研究发现，PRV对育肥猪的致病性显著增强，并以呼吸道和发育障碍为主要症状[4]，但仅靠临床诊断，无法确诊PRV感染，需要借助实验室诊断。

目前，PR主要依靠接种商品化的减毒活疫苗和基因缺失疫苗进行预防。PRV核酸为双链 DNA，其编码的gE蛋白是一种重要的神经毒性因子，在基因缺失疫苗毒株中，该基因通常被剔除[5-6]。因此，在实验室诊断中，通常采用PCR检测gE基因，以区分野毒和疫苗毒，亦可配合gE蛋白特异性抗体检测进行鉴别诊断[7-8]。2017年4月衡阳市某猪场育肥猪发生疑似PR疫情。为确诊疫情，采集发病猪脾脏进行了实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

Vero细胞：衡阳师范学院生命科学与环境学院生物技术重点实验室培养保存；PRV强毒株阳性对照和PRV阳性血清：衡阳师范学院生命科学与环境学院生物技术重点实验室制备保存；血液/细胞/组织DNA提取试剂盒：购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清：购自Gibico公司；MEM培养基：购自北京清大天一科技有限公司；Premix Ex Taq酶：购自宝生物工程（大连）有限公司；体重1.5 kg左右雌性新西兰大白兔：购自南华大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病料采集与处理 采集发病猪脾脏，研磨加入MEM 细胞培养液制成组织悬液，反复冻融 3 次后，3 000 r/min离心2 min，取上清，用0.22 μm滤膜过滤，滤液于-20 ℃ 冰箱保存备用。

1.2.2 DNA提取与PCR检测 取1.2.1中滤液200µL，用血液/细胞/组织DNA提取试剂盒提取DNA样本。根据 GenBank 中PRV HN1201毒株的基因组序列（KP722022.1）设计1对特异性引物（PRV-gE-F/R和PRV-gG-F/R）进行PCR检测（表1）。PCR反应体系包含：模板DNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；98 ℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃10 min，4 ℃保存。取PCR反应产物5 μL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 病毒分离培养与血清学鉴定 当Vero细胞生长至密度为80%的汇合度时，去培养液，用PBS洗涤1次，加入无血清MEM培养基，按照体积比10:1的比例加入1.2.1中滤液，摇匀后，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔1 d观察1次。当80%细胞出现细胞病变（CPE）时，收集培养物，反复冻融3次，取冻融物接种健康细胞，进行传代培养。将分离的病毒，采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）进行血清学鉴定，根据文献[16]改进后进行。将Vero细胞接种35 mm培养皿中，当Vero细胞生长至密度为80%的汇合度时，接种培养物，1 d后弃培养基；将细胞用2 mL PBS洗涤3次，真空干燥，加入1.5 mL 30 %丙酮-PBS固定30 min，干燥，加入1.5 mL 稀释好的PRV多克隆抗体（1∶100），37 ℃孵育1 h；用PBS洗涤3次，加入1.5 mL酶标二抗HRP-SPA（1∶3 000），37 ℃孵育1 h；用PBS洗涤3次，加入1.5 mL AEC底物显色液，37 ℃孵育15 min；弃掉反应液，用蒸馏水洗涤1次，在显微镜观察结果。

表1 引物序列及其反应条件

1.2.4 家兔感染试验 将实验家兔分成3组，每组2只：A组腹腔注射F3代分离培养物1 mL，B组注射F3代分离培养物4 mL，C组为不接种对照。每隔12 h观察症状。待出现明显临床症状后，进行剖检观察病理变化，并取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织，提取DNA进行PRV核酸检测。

2 结果

2.1 PCR检测

取病料处理液进行PCR检测，发现病猪脾脏组织为PRV-gE和gG基因核酸阳性（图1）。

2.2 病毒细胞培养与血清学鉴定

将处理过的病料接种Vero细胞，培养3 d，发现接种细胞出现明显细胞病变——细胞变圆、脱落、拉丝、融合成合胞体（图2-A），未接种病毒对照细胞生长正常（图2-B）。连续接种培养3代，均表现出一致CPE。

IPMA结果显示，接种病毒的培养皿中，被感染的Vero细胞反应呈阳性，细胞核和细胞质均染成棕红色，细胞质着色浓于细胞核，未感染的细胞无着色（图3-A）。未接种病毒的对照细胞无任何着色（图3-B）。

图1 脾脏组织病料中PRV核酸的PCR检测

图2 病毒的分离培养

图3 细胞传代病毒（F3代）的血清学鉴定

2.3 家兔感染试验

2.3.1 临床症状 A组家兔：腹泻，偶有瘙痒，用爪子挠腹部，挠痒频率较高，接种病毒后约60 h死亡。B组精神萎靡，腹泻、食欲不振，只饮水，剧烈挠腹部，随后四肢麻痹，角弓反张死亡，接种病毒后30 h死亡。健康对照兔子观察1周无任何症状，存活。

2.3.2 家兔脏器的PRV-gE核酸检测 PCR检测结果表明，A组中肝脏和脾脏为PRV-gE核酸阳性，心脏、肺脏、肾脏为PRV-gE阴性（图4）；B组中肝脏、脾脏、肺脏为PRV-gE核酸阳性，心脏、肾脏为PRV-gE阴性（图5）。

图4 A组脏器中PRV-gE PCR核酸检测

图5 B组脏器中PRV-gE核酸的PCR检测

3 讨论

本研究应用病毒分离传代培养、PCR检测和动物感染试验等方法，对一例疑似PRV感染病例进行了鉴定。实验室检测结果表明，该病例为PRV野毒感染。

发病猪脾脏组织样品的PRV-gE和PRV-gG核酸阳性。病料接种Vero细胞3 d后，出现典型的PRV细胞病变——细胞变圆和细胞融，且培养物连续培养3代，均表现出稳定的特征性CPE。这与其他研究人员将病毒接种到MDCK、鸡胚成纤维细胞、BHK-21、PK-15也出现同样CPE的结果一致[9-11]。

用分离培养的PRV F3代病毒感染家兔，可使家兔出现腹泻、奇痒、四肢麻痹神经症状，而未感染家兔精神状况良好。A组家兔从接种PRV到死亡共存活60 h，B组家兔存活30 h，与刘澜等[12]、祁贤等[13]报道的结果相似。但本试验未观察到江焕贤等[14]报道的接种部位被毛脱落、皮肤撕破等现象。推测这可能是其在研究过程中病毒接种剂量较大引起的。取感染家兔的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织进行PCR扩增，发现A组肺脏为PRV-gE核酸阴性，而B组为PRV-gE核酸阳性，且B组中肺脏病毒含量比其他脏器大。郭丽静[15]采用PRV强毒株对4头19日龄未免疫的断奶仔猪攻毒，取攻毒仔猪扁桃体等脏器组织进行PRV-gE核酸检测，发现脾脏检出率为100%，而肺脏检出率仅为50%。这种病毒脏器分布的差异性可能跟病毒的感染嗜性、接种剂量及病程有关，具体机制尚待进一步研究。