河南省猪流行性腹泻病毒S和ORF3基因的克隆与序列分析

赵 丽，韩昊莹，张鸿鑫，卢婷婷，王文静，陈红英

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450011；2.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；3.郑州市猪重大疫病防控重点实验室，河南 郑州 450002)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病。在临床上可导致各种年龄的猪发生呕吐、水样腹泻、脱水等症状，其中，新生仔猪的发病率和死亡率可达100%[1]。该病在世界范围内均有发生，尤其以欧洲和亚洲最为严重[2-3]。由于PEDV疫苗在我国的使用，该病得到有效控制，但2010年10月以来，PED在河南省呈现暴发流行，仔猪病死率高达100%，而且免疫猪场也没能幸免，给我国养猪业带来严重的经济损失[4-5]。

PEDV为有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组全长28 kb，编码的主要结构蛋白包括纤突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白[6]。研究发现，S蛋白在感染宿主体内介导中和抗体的产生、特异性受体的结合以及细胞膜融合方面发挥重要的生物学作用[7-8]，同时，S蛋白的变异会引起PEDV宿主范围、组织细胞培养及其毒力发生改变[9]。由于S基因在遗传进化分析上存在较高的变异性，不同分离株S基因之间存在不同程度的核苷酸插入、突变和删减等现象，因此，其常被用来研究不同时间和不同地区流行毒株的亲缘关系[10-11]。ORF3基因位于E蛋白与S蛋白之间，长675 bp，编码224个氨基酸多肽，分子量为25.3 ku。该基因的缺失不影响病毒的增殖与复制，但会导致病毒在宿主体内的毒力弱化[12]。

本研究于2015年1-12月对来自河南省不同猪场的150份临床病料进行了RT-PCR检测，对PEDV的S基因和ORF3基因进行克隆和测序并进行序列分析，旨在为该病的分子流行病学研究和制定有效的防控措施提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 2015年1-12月收集的来自河南省规模化猪场疑似猪流行性腹泻的病猪小肠和粪便，-70 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂TaqDNA聚合酶、RNA抽提试剂TRIzol、dNTPs、DNA Marker DL2000、DNA凝胶回收纯化试剂盒等，均购自北京康为生物工程有限公司。pMD18-T载体、感受态细胞DH5α、限制性内切酶EcoRⅠ、Pst Ⅰ等，均购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR引物的设计 依据GenBank已公布的PEDV CV777株全基因组序列(登录号AF353511)中S和ORF3基因，利用引物设计软件Obligo 7.0和Primer 6.0，设计3对特异性引物(表1)用于扩增PEDVS1、S2和ORF3基因全序列，扩增片段长度分别为2 300，2 100，850 bp，引物由北京三博生物工程公司合成。

表1 PEDV扩增引物Tab.1 The specific amplification primes for S1， S2 and ORF3of PEDV

1.2.2 样本处理及RNA的提取 取少量小肠肠道及其内容物或粪便，使用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)进行5倍稀释后研磨，反复冻融2～3次，8 000 r/min离心10 min，取上清。按照TRIzol Reagent试剂盒使用说明书进行总RNA提取，置于-20 ℃保存。

1.2.3 RT-PCR检测PEDV 提取的总RNA按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4S和ORF3基因的克隆及测序 以RT-PCR检测为阳性样品的cDNA为模板，进行S和ORF3基因的扩增。将目的基因连接至pMD18-T载体。对重组质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，阳性克隆送至上海生物工程股份有限公司测序。

1.3 数据分析

利用DNAStar软件对15株PEDV河南地区流行毒株及参考毒株的S和ORF3基因进行核苷酸序列和氨基酸序列分析；利用MegAlign构建系统进化树并分析。

2 结果与分析

2.1 临床病料检测结果

2015年1-12月共检测河南省不同规模猪场的150份临床病料，结果显示，有108份病料能扩增出与目的基因一致的特异性条带，总体检出率为72%，说明PEDV为引起河南省仔猪腹泻的主要病原之一。其中对不同月份的 PEDV检测结果进行统计发现，2015年的2-4月的临床病料PEDV检出率最高，每年的7-8月PEDV检出率最低。

2.2 PEDV S和ORF3目的基因RT-PCR扩增

利用3对引物分别对15株具有代表性的PEDV的S和ORF3基因进行RT-PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，与预期目的条带一致(图1)。

DNA 标准 DL2000；1.PEDV S1基因的RT-PCR扩增产物；2.PEDV S2基因的RT-PCR扩增产物；3.PEDV ORF3基因的RT-PCR扩增产物；4.阴性对照。M.DNA Marker DL2000；1.RT-PCR product of PEDV S1；2.RT-PCR product of PEDV S2；3.RT-PCR product of PEDV ORF3 gene；4.Negative control.

2.3 基因序列测序结果

对15株河南流行毒株的S和ORF3基因进行PCR扩增、克隆和序列测定可知，通过NCBI Blast分析与已公布的PEDVS和ORF3基因序列同源性均高达95%以上，表明成功克隆了15株PEDV河南株S和ORF3基因序列，同时将所测序列提交GenBank，序列号见表2。

表2 PEDV基因序列分析样品与参考毒株信息Tab.2 Analysis of PEDV gene sequence samples and reference plant information

2.4 基因同源性分析

运用DNAStar软件中的Clustal W method对15个毒株的S基因序列进行比对分析，结果表明，各毒株之间的核苷酸同源性为97.7%～99.5%，氨基酸同源性为97.0%～99.1%。与GenBank中登录的代表性参考株相比，核苷酸同源性为93.2%～99.0%，氨基酸同源性为92.3%～98.8%。与经典株CV777相比，核苷酸同源性为93.6%～93.9%，氨基酸同源性为92.2%～93.1%。而且各毒株除了多处点突变之外，还存在碱基的插入和缺失现象，各毒株与CV777相比，在163 ～165 bp处存在3个碱基插入，在177～185 bp处有9个碱基的插入，在206 bp处有1个碱基插入，在416～418 bp处有3个碱基插入；同时，在218 bp处缺失1个碱基，在480～482 bp处缺失3个碱基。

本研究所扩增的ORF3基因均含675个碱基，编码224个氨基酸残基。对15株PEDVORF3基因比对可知，各毒株之间的核苷酸同源性为97.2%～100%，氨基酸同源性为95.1%～100%。与GenBank中登录的代表性参考株相比，核苷酸同源性为95.0%～100%，氨基酸同源性为93.7%～100%。与经典株CV777相比，核苷酸同源性为97.7%～100%，氨基酸同源性为93.7%～100%。本研究毒株与疫苗毒株CV777相比，河南株在氨基酸82-98位点上不存在17个氨基酸的缺失；与疫苗株attenuated DR13相比，在82-99氨基酸位点上不存在18个氨基酸的连续缺失现象。

2.5 基因序列进化树分析

用MEGA6软件，将本试验中扩增得到的15株S基因核苷酸序列，与GenBank 中已发布的10株PEDV参考毒株序列一同构建系统进化树，可将PEDVS基因分为两大群(图2)。其中本试验扩增的15株则独立成群，构成G2群(标记▲)，与其他参考毒株亲缘关系较远。对于ORF3基因，可将PEDVORF3基因分为2个群(图3)。其中Ⅰ群包括CV777株和attenuated DR13；除Ⅰ群之外，其他所有毒株可归为Ⅱ群，其中，本研究的15个PEDV毒株(标记▲)与国内分离株(CH-S、AJ1102、CH-ZMDZY-2011、GD-1、LZC)、美国株(USA-Colorado-2013、USA-Iowa-18984-2013)及韩国株DR13均有较近的亲缘关系；同时，对于S和ORF3基因在整个进化关系中，本试验中的15个河南株均相对独立成群，与经典毒株CV777及国内所使用的疫苗株，亲缘关系较远。

▲.河南株；○.国内分离株。图3同。▲.Isolates from Henan；○.Domestic isolates.The same as Fig.3.

图3 PEDV ORF 3基因核苷酸序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic analysis according to the sequences of PEDV 3 genes

3 结论与讨论

2010年10月份开始，PED在我国大面积暴发流行，导致上百万头仔猪死亡[13]，给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究通过对2015年1-12月采集的35家猪场150份的疑似流行性腹泻的粪便及肠内容物进行RT-PCR检测，得到阳性率为72%(108/150)，而这些猪场几乎都免疫了PEDV基于CV777毒株的疫苗，表明河南省2015年猪场PEDV具有普遍流行的特点，疫苗已经不能为现有的流行毒株提供有效的抗体保护。

PEDV毒株是单一血清型，但是发病猪场使用了CV777疫苗免疫后，仔猪的发病率和死亡率依旧高发，说明流行毒株极有可能发生了变异或者毒力增强导致疫苗株的免疫保护效果不足以保护猪群免于感染发病[14]。通过对采集病料的S基因和ORF3基因的遗传演化关系表明，2015年河南省临床检测到的PEDVS基因有了较大的变异，与经典毒株CV777相比较，除了点突变外，在163 ～165 bp处存在3个碱基插入，在177～185 bp处有9个碱基的插入，在206 bp处有1个碱基插入，在416～418 bp处插入3个碱基；同时，在218 bp处缺失1个碱基，在480～482 bp处缺失3个碱基。2015年河南省临床检测到的 PEDV株与CV777核苷酸同源性为93.6%～93.9%，氨基酸同源性为92.2%～93.1%，这与陈建飞等[15]发现的不同地区的病毒毒株结果有明显的差异；王飞等[16]、刘文俊等[17]、霍金辉等[18]发现PEDV的S和ORF3基因发生变异的结果相符合。

河南省15株PEDVS基因测序毒株与国内外毒株序列S基因遗传演化关系表明，对于S和ORF3基因在整个进化关系中，本试验中的具有代表性的15个河南株均相对独立成群，与经典毒株CV777及国内所使用的疫苗株，亲缘关系较远。这与乔涵等[19]对河南地区猪流行性腹泻病毒所做的PEDVS基因序列分析的结果一致。沈永恕等[20]通过对河南省2011年猪流行性腹泻M基因遗传进化分析，说明2011年河南省流行的猪流行性腹泻是一个新的基因型。正是由于现在流行的毒株与现有的疫苗株亲缘关系较远，使用的疫苗不能完全保护猪群免受病毒的侵害，这可能是导致猪流行性腹泻在免疫猪群中流行的原因。