在线热辅助甲基化-气相色谱法分析棉籽仁中的脂肪酸组成

邱若风, 黄忠平, 王丽丽

(浙江工业大学化学工程学院, 浙江 杭州 310014)

棉花是一种重要的纤维原料,与大豆、花生、油菜、向日葵共同被列为我国的五大油料作物。文献[1]报道棉籽剥壳后的棉籽仁含油量约15%～40%。虽然棉籽中含有棉酚等有毒物质,但是随着低酚棉研究的深入和脱酚技术的发展,精炼后的棉籽油可以放心食用。

棉籽油含有大量人体必需的脂肪酸,其中不饱和脂肪酸的含量接近70%,具有较高的营养价值,是一种有益于人体健康的优质食用油。同时棉籽油含有多种饱和脂肪酸,可以用作起酥油和人造奶油等[2]。目前,欧美国家限制使用含有反式脂肪酸的氢化植物油,而棉籽油不含反式脂肪酸,可以作为一种天然替代品[3]。同时,棉籽油中的脂肪酸经过分离后可以作为工业原料生产肥皂、润滑油和甘油等。近年来,随着人们环保意识的提高,棉籽可以作为一种可再生的油料作物,棉籽油可以用来制备生物柴油[4,5]。

我国的棉花产量居世界前列。棉籽作为棉花的一部分,产量很大,如何有效地利用这一资源是我国棉花产业发展的重点之一。无论是评价棉籽油的营养价值,还是考查棉籽油用作工业原料的可能性,我们都要研究棉籽油的脂肪酸组成。文献报道可采用索氏提取法[6,7]、微波辅助提取法[8]等提取棉籽中的棉籽油。商连光等[6]采用近红外光谱法直接分析提取后的棉籽油,但该方法不能具体测定各种脂肪酸的含量。有的文献[7,8]先将提取到的棉籽油进行离线甲酯化,再用气相色谱-质谱法分析甲酯化后的棉籽油。但上述方法均需要大量有机试剂,前处理步骤耗时较长。

在线热辅助甲基化-气相色谱法是近年来迅速发展的一种适用于分析有机酸、多羟基醇、酯类、胺类等物质的方法[9]。目前已有采用该方法并以四甲基氢氧化铵为甲基化试剂测定非正常食用油中脂肪酸组成的报道[10]。但是棉籽仁中含有较多的不饱和脂肪酸,碱性很强的甲基化试剂会使多不饱和脂肪酸的双键发生异构化和降解[11],因此在测定棉籽仁中的脂肪酸时需要选择合适的甲基化试剂。

本文采用在线热辅助甲基化-气相色谱法对棉籽仁中的脂肪酸组成进行分析,对影响测定的主要因素如甲基化试剂、甲基化温度等进行优化,旨在建立分析棉籽仁中脂肪酸组成的方法。同时对市售食用油中的脂肪酸组成进行分析,比较棉籽仁和食用油的脂肪酸组成。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

GC-2010 Plus气相色谱仪配有氢火焰离子化检测器、GCMS-QP2010 SE气相色谱-质谱联用仪(日本Shimadzu公司); PY-2020iD微型纵炉裂解器(日本Frontier Lab公司); BP211D分析天平(德国Sartorius公司); SQ-80B超声振荡器(中国无锡同建科技有限公司)。

甲醇(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司);肉豆蔻酸甲酯(C14∶0)、棕榈酸甲酯(C16∶0)、棕榈油酸甲酯(C16∶1)、硬脂酸甲酯(C18∶0)、油酸甲酯(C18∶1)、亚油酸甲酯(C18∶1)、亚麻酸甲酯(C18∶3)、三甲基氢氧化硫(TMSH, 溶于0.2 mol/L甲醇溶液)、四甲基氢氧化铵(TMAH,分析纯)购自上海阿拉丁公司。

5组棉籽产地分别为河南安阳(HNAY)、海南三亚(HNSY)、江苏南京(JSNJ)、浙江金华(ZJJH)、浙江杭州(ZJHZ 1～5);食用油包括花生油、玉米油、葵花籽油。

1.2 溶液的配制

准确称取四甲基氢氧化铵固体,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,超声溶解,配制成质量分数为2%的四甲基氢氧化铵甲醇溶液,于4 ℃冰箱中保存。

1.3 样品前处理

固体样品:将棉籽去壳后碾碎成粉末,备用。液体样品:称取食用油样品各5 mg,用甲醇定容至1 mL。

如图1所示,取约0.3 mg固体样品或1 μL液体样品,置于样品杯中,加入2 μL甲基化试剂,将样品杯固定在进样杆上,装入裂解器,待仪器稳定后,按下进样按钮,样品杯迅速落到裂解器的加热区,样品中的脂肪酸与甲基化试剂在高温下瞬间反应生成相应的甲基化产物,同时启动气相色谱仪开始分析。

图 1 在线热辅助甲基化-气相色谱-质谱系统的示意图Fig. 1 Schematic diagram of on-line pyrolytic methylation-GC/MS system

1.4 分析条件

色谱柱:DB-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, 5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷);程序升温条件:初始温度50 ℃,以10 ℃/min升温至200 ℃,保持10 min,再以10 ℃/min升温至300 ℃,保持10 min;汽化室温度：300 ℃;检测器温度:300 ℃;载气:高纯氮气,分流比100∶1;柱流量:1 mL/min;裂解炉温度：350 ℃;接口温度：300 ℃。

离子源:电子轰击源;离子源温度:220 ℃;载气:高纯氦气;传输线温度:270 ℃;电离电压:70 eV;扫描范围:m/z50～600。

图 2 添加(a)TMAH和(b)添加TMSH时棉籽仁的 甲基化-气相色谱图Fig. 2 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed with (a) TMAH and (b) TMSH C18∶2: methyl linoleate; TMAH: tetramethylammonium hydroxide; TMSH: trimethylsulfonium hydroxide.

2 结果与讨论

2.1 在线热辅助甲基化-气相色谱条件的优化

2.1.1甲基化试剂的选择

由于棉籽仁中含有多不饱和脂肪酸,例如亚油酸,为了消除衍生化反应对多不饱和脂肪酸的异构化作用,比较了TMAH和TMSH对脂肪酸的甲基化效果。图2为棉籽仁在添加TMAH和TMSH条件下得到的在线甲基化-气相色谱图。经过质谱定性可以发现,当使用TMAH作为甲基化试剂时可以观察到亚油酸甲酯的异构体,而使用TMSH时未观察到亚油酸甲酯的异构体。该结果表明使用TMSH能提高测定多不饱和组分的灵敏度,同时不会降低对饱和组分的测定结果。因此,选择TMSH作为甲基化试剂。

2.1.2温度对甲基化效率的影响

温度对在线甲基化反应的影响十分明显,若温度过低,甲基化反应不完全;若温度过高,三甲基氢氧化硫易发生分解,会造成样品的损失,甲基化反应不完全。在300、350和400 ℃温度下对0.3 mg棉籽仁粉末进行在线热辅助甲基化-气相色谱分析,可以看出,不同温度下硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯的响应情况(见图3)。当温度由300 ℃上升到350 ℃时,3种脂肪酸甲酯的峰面积增大;当温度由350 ℃上升到400 ℃时,3种脂肪酸甲酯的峰面积基本不变。因此,选择甲基化温度为350 ℃。

图 3 温度对脂肪酸甲基化效率的影响Fig. 3 Effect of temperature on the methylation efficiency of fatty acids

2.1.3甲基化试剂用量的选择

甲基化试剂的用量会影响脂肪酸的甲基化效率。甲基化试剂的用量过少,导致脂肪酸的甲基化反应不完全;用量过多,不仅浪费试剂,还会降低脂肪酸的甲基化效率。实验考察了当甲基化试剂用量为1、2和3 μL时0.3 mg棉籽仁中3种脂肪酸的甲基化效率(见图4)。可以看出,随着甲基化试剂用量的增加,饱和脂肪酸硬脂酸的甲基化效率有所增加,而不饱和脂肪酸油酸和亚油酸的甲基化效率下降。可能是因为在高温、碱性较高的环境中目标物发生异构化或者分解。因此,选择甲基化试剂的用量为2 μL。

2.2 棉籽仁中脂肪酸组成的测定

棉籽仁中脂肪酸的定性采用标准品保留时间对照结合质谱定性。8种脂肪酸甲酯的气相色谱保留时间及质谱特征离子见表1。图5为不同产地的棉籽仁的在线甲基化-气相色谱图。从图中可以看出,8种脂肪酸甲酯得到较好分离,分别为肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、花生酸和二十二酸。采用峰面积归一化法进行定量,计算棉籽仁中各种脂肪酸的含量,其脂肪酸组成见表2(花生酸与二十二酸含量较低,未进行定量计算)。

图 4 TMSH用量对脂肪酸甲基化效率的影响Fig. 4 Effect of the volume of TMSH on the methylation efficiency of fatty acidsC18∶0: methyl stearate; C18∶1: methyl oleate.

No.Retention time/minFatty acid methyl esterCharacteristic ions (m/z)116.25methyl myristate (C14∶0)74, 199, 211, 242219.45methyl palmitoleate (C16∶1)55, 194, 236, 268319.91methyl palmitate (C16∶0)74, 227, 239, 270425.24methyl linoleate67, 220, 263, 294525.44methyl oleate55, 222, 264, 296626.24methyl stearate74, 255, 267, 298730.32methyl arachidate (C20∶0)74, 283, 295, 326832.88methyl docosanoate (C22∶0)74, 311, 323, 354

图 5 棉籽仁的在线甲基化-气相色谱图Fig. 5 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed HNAY: Henan Anyang; JSNJ: Jiangsu Nanjing; HNSY: Hainan Sanya; ZJJH: Zhejiang Jinhua; ZJHZ: Zhejiang Hangzhou.

2.3 食用油中脂肪酸组成的测定

食用油中脂肪酸的定性采用标准品保留时间对照结合质谱定性。图6为3种食用油的在线甲基化-气相色谱图。从图中可以看出,8种脂肪酸甲酯得到较好分离,分别为肉豆蔻酸、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸花生酸和二十二酸。采用峰面积归一化法进行定量,计算食用油中各种脂肪酸的含量,其脂肪酸组成见表2(玉米油和葵花籽油中花生酸与二十二酸含量较低,未进行定量计算)。

图 6 3种食用油的在线甲基化-气相色谱图Fig. 6 On-line methylation-GC chromatograms of three kinds of edible oils

2.4 棉籽仁与食用油中脂肪酸组成的比较

由表2可知,9个棉籽仁样品中亚油酸的含量为43.20%～53.61%,棕榈酸的含量为24.15%～27.30%,油酸的含量为16.51%～27.00%,硬脂酸的含量为2.32%～5.29%,肉豆蔻酸的含量为0.85%～1.11%,棕榈油酸的含量为0.42%～0.85%。这与文献[12]报道的基本一致。

棉籽仁中的不饱和脂肪酸有棕榈油酸、油酸、亚油酸,占脂肪酸总含量的66.30%～72.54%，其中油酸的相对含量为16.51%～27.00%,亚油酸的相对含量为43.20%～53.61%。研究[13,14]表明,油酸和亚油酸通过参与人体的各种生理过程,起到降低血压、血脂的作用,具有预防心脑血管疾病的功效。

棉籽仁中含有的饱和脂肪酸主要有肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸,占总脂肪酸相对含量的27.46%～33.70%，其中棕榈酸的相对含量为24.15%～27.30%。研究[15]表明,棕榈酸不易氧化,具有良好的起酥性和稳定性,可用于食品制造业。文献[4]报道,以棉籽油为原料制备的生物柴油具有十六烷值高、可再生等优点。

为了分析不同产地棉籽仁中脂肪酸组成的差异,采用SPSS统计软件对表2的结果进行相似性分析。由相似矩阵可知,5个产地的9个棉籽仁样品之间的相似度均大于0.974,说明5个产地的9个棉籽仁样品的脂肪酸相对含量差异不明显,因此在棉籽油的开发和利用过程中无需考虑不同品种和地区之间差异性的影响。

表 2 不同产地棉籽仁与食用油中脂肪酸的相对含量

-: no data.

图 7 9个棉籽仁样品和8个食用油样品的主成分分析Fig. 7 Principal component analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

图 8 9个棉籽仁样品和8个食用油样品的系统聚类分析Fig. 8 Hierarchical cluster analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

为了比较棉籽仁与食用油中脂肪酸组成的差异,将表2的峰面积百分含量输入SPSS统计软件,调用因子分析模块进行主成分分析。图7为提取两个主成分得到的9个棉籽仁样品和8个食用油样品的主成分分析图。由图7可见,棉籽仁聚成一组,与3种食用油明显区分开来。

采用SPSS统计软件对表2中的数据进行了聚类分析。图8为9个棉籽仁样品和8个食用油样品的系统聚类分析树状图,更直观地显示了样品逐步合并的过程。横坐标为临界值,即类间的距离,纵坐标为样品名称。临界值越小,表示谱图越相似。当临界值小于10时,棉籽仁与玉米油、葵花籽油聚为一类，表明棉籽仁中的脂肪酸组成和玉米油、葵花籽油相似。在相似性分析中，棉籽仁中的脂肪酸组成与玉米油的相似度为0.960～0.992。

以上结果表明,棉籽油作为食用油具有较高的营养价值,如果将棉籽油中的脂肪酸进行分离可用作工业原料。

3 结论

建立了测定棉籽仁中脂肪酸组成的在线热辅助甲基化-气相色谱法。利用建立的方法对5个产地的棉籽仁和3种食用油的脂肪酸组成进行分析,结果表明，不同产地棉籽仁的脂肪酸组成差异不明显,且棉籽仁的脂肪酸组成与玉米油最为接近。棉籽油作为食用油具有较高的营养价值,如果将棉籽油中的脂肪酸进行分离可用作工业原料。该方法简单、快速、准确,适合分析棉籽仁和食用油中的脂肪酸组成。