分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定常见动物源性食品中42种兽药残留

覃 玲, 董亚蕾, 王钢力, 曹 进, 丁 宏

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

兽药在防病治病、促进生长方面应用广泛,但在畜牧养殖过程中存在一定的滥用、误用现象,常造成药物在动物体内的蓄积,进而引起相应食材的污染,可能使人体产生耐药性或过敏反应等副作用,威胁人民饮食健康。目前国际上通常用最大残留限量(MRLs)值作为判断动物源性食品质量安全的标准,比较成熟的MRLs标准体系主要有国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、美国、日本以及中国等[1-3]。建立快速、灵敏、简便、可靠的兽药残留检测方法势在必行,对于保障人民饮食安全具有重要意义。

目前,国内外的兽药残留检测方法主要有液相色谱-三重四极杆质谱[4-7]、液相色谱-四极杆飞行时间质谱[8,9]和液相色谱-四极杆离子阱质谱[10-12]。针对磺胺类[13]、喹诺酮类[14]、糖皮质激素类[15]、β-受体激动剂类[16]等单类兽药的检测已有诸多研究,而这些分析方法所能同时分析的药物种类较少,无法满足目前兽药种类不断增加的检测需求,不利于潜在风险的发现。动物源性食品中多类兽药残留同时分析方法的开发具有广阔的应用前景,可缩短检测周期,降低检测成本,提高检测效率[17,18]。

在前处理技术方面,动物源性食品中兽药残留分析常采用液-液萃取[17]、固相萃取[19-22]、分散固相萃取[23-25]等方法,以去除基质干扰,净化目标化合物,提高多兽药残留检测的灵敏度。本文选择猪肉、牛肉鲜肉样品及猪肉脯、牛肉干干肉制品4种代表性基质,应用分散固相萃取方法结合液相色谱-串联质谱,建立了同时测定磺胺类(9种)、β-受体激动剂类(8种)、喹诺酮类(7种)、糖皮质激素类(6种)、孕激素类(2种)、氯霉素类(2种)、镇静剂类(2种)以及雄激素类、硝基咪唑类、苯并咪唑类、抗病毒类、林可胺类、大环内酯类(各1种)共13类42种兽药残留的分析方法,为动物源性食品中多兽药残留的多成分快速筛查与确认提供检测依据。本文在传统兽药残留检测选取的鲜肉基质基础上,考察了更为复杂的肉制品基质,具有一定的创新性。分散固相萃取前处理方法较传统固相萃取前处理方法更为快速、便捷,具有更广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-MS 8060三重四极杆液相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司); arium pro-DI-B纯水机(德国Sartorius公司); CF 16RXⅡ离心机(日本HITACHI公司); XP205分析天平(十万分之一)和AL204分析天平(万分之一)(瑞士Mettler公司)。

甲醇、乙腈(均为质谱纯,ThermoFisher公司);甲酸(质谱纯,Fluka公司);甲酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);实验室用水为超纯水;WondaPak QuEChERS多兽残专用提取包与净化包(日本岛津技迩公司); 42种兽药标准品分别购自德国Dr. Ehrenstorfer公司和中国食品药品检定研究院,纯度90.3%～99.9%。

实际样品购自当地超市。

1.2 标准溶液的配制

分别以甲醇配制质量浓度为1 g/L的各兽药标准储备液,其中吡哌酸用10%(v/v)醋酸甲醇溶液配制。取适量储备液,以甲醇配制42种兽药混合标准溶液,其中妥洛特罗、班布特罗、氟哌啶醇的质量浓度为10 mg/L,其余为50 mg/L,置于-18 ℃下避光保存。

分别吸取适量标准工作溶液用空白基质提取液稀释定容,配制成不同浓度的基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理方法

鲜肉样品:准确称取均质后的样品2.50 g于50 mL塑料离心管中,加入3 mL水涡旋混合1 min,再加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈涡旋混合1 min,超声提取10 min。加入WondaPak QuEChERS多兽残专用提取包4 g,剧烈振摇1 min,于10 ℃以8 000 r/min下离心10 min。取1 mL上清液转移至WondaPak QuEChERS多兽残专用净化包中,涡旋混合1 min, 12 000 r/min下离心5 min。取上清液,过0.22 μm微孔滤膜,取滤液进行LC-MS/MS分析。

干肉制品:准确称取绞碎后样品2.50 g于50 mL塑料离心管中,直接加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈,同法进行提取与净化。

1.4 仪器条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:Shim-pack GIST C18柱(100 mm×2.1 mm, 2 μm);柱温:30 ℃;进样量:5 μL;流动相:A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为甲醇。梯度洗脱程序:0～4 min, 5%B～30%B; 4～10 min, 30%B～60%B; 10～12 min, 60%B～95%B; 12～17 min, 95%B; 17～18 min, 95%B～5%B; 18～23 min, 5%B。

1.4.2质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:多反应监测(MRM)扫描;雾化气流速:3 L/min;干燥气流速:5 L/min;加热气流速:15 L/min;加热模块温度:300 ℃;脱溶剂管温度:250 ℃;离子源温度:250 ℃。42种兽药的其他质谱参数见表1。

表 1 42种兽药的质谱参数

tR: retention time; CE: collision energy. *Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本研究对比了Shim-pack GIST C18柱和Waters CORTECS UPLC C18柱的分离效果,发现后者喹诺酮类化合物峰形差、响应低,磺胺噻唑、地西泮、炔诺酮峰分叉;而前者的分离效果和峰形都更优,因此最终选用Shim-pack GIST C18柱。

本研究采用甲醇作为有机相,考察了在水相中添加0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸铵、10 mmol/L甲酸铵对色谱分离和质谱响应的影响。结果发现,添加甲酸铵和乙酸铵时喹诺酮类化合物峰形差、响应低;添加甲酸时提高了在正离子模式下检测的目标物的响应值,在负离子模式下检测的3种目标物也能获得合适的响应值,且峰形良好、分离效果佳。因此,本研究最终采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作为流动相。42种兽药化合物的总离子流图见图1。

图 1 42种兽药的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatograms of the 42 veterinary drugsFor peak Nos., see Table 1.

2.2 质谱条件的优化

在电喷雾离子源下,分别对各兽药化合物的标准溶液进行正离子和负离子全扫描,确定各化合物的准分子离子;将其作为母离子进行二级质谱扫描,选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为特征离子,其中丰度相对最强的为定量离子,其次为定性离子;进一步优化碰撞能量和Q1、Q3四极杆电压。优化得到的质谱参数见表1。

在多残留检测中,离子驻留时间(dwell time)对灵敏度和定量准确性有重要影响。采集通道的增加会使分配给每个采集通道的离子驻留时间减少,而维持长的离子驻留时间又会影响每个MRM通道的采集点数,进而影响图谱质量与定量准确性。为了保证同时检测42种兽药的灵敏度与准确性,需要权衡离子驻留时间和采集点数两个因素。本研究采用分段扫描模式进行不同化合物数据的采集,根据出峰时间分为4段:3～7 min, 6～8 min, 7～12 min, 11～15 min;从而减少了采集通道的冗余,保证了离子的驻留时间。

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1提取溶剂的选择

本研究涉及的42种兽药极性较强,而畜肉中主要基质干扰是蛋白质、脂肪及少量色素。选取极性溶剂进行提取,可保证提取效率,又尽可能地去除了基质中的干扰物。乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白质及提取目标化合物的能力,然而用甲醇提取时会带入更多的极性基质干扰物,影响提取效率,因此选择乙腈作为提取溶剂。以猪肉基质为例,当在乙腈中加入适量甲酸或乙酸时,由于大部分目标化合物呈弱碱性,离子化效率得到提高,平均提取回收率明显增加;而甲酸酸性强于乙酸,平均提取回收率稍大于乙酸。实验进一步对乙腈中甲酸的添加比例进行了探索,发现5%(v/v)甲酸乙腈的平均提取回收率高于1%(v/v)甲酸乙腈与10%(v/v)甲酸乙腈;其中磺胺类化合物在酸度偏低时,在溶液中的解离度降低,影响了提取回收率;而在酸度偏高时,可能发生一定程度的降解,也影响提取回收率[26]。本研究还进行了80%(v/v)乙腈水溶液的提取回收率实验,发现不如5%(v/v)甲酸乙腈的提取回收率高。因此,最终选择5%(v/v)甲酸乙腈作为提取溶剂。不同提取溶剂对42种兽药平均回收率的影响见图2。

图 2 不同提取溶剂对42种兽药平均回收率的影响Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the average recoveries of the 42 veterinary drugsMeOH: methanol; HAc: acetic acid; ACN: acetonitrile.

由于畜肉样品比较黏稠,绞碎后不容易分散。匀浆机广泛用于分散畜肉样品,然而部分样品会附着在匀浆机的捣杆上造成目标化合物的损失。实验发现,水具有良好的组织渗透性,当在样品中预先加入水时,能够良好地分散样品,增加有机溶剂与样品的接触面积;而且水的极性强,对于强极性化合物的提取能力也强。因此,在提取样品时应预先加入少量水分散样品。干肉制品黏稠度小,直接采用提取溶剂就可均匀分散,不需加入水。

2.3.2净化条件的选择

本研究涉及13类兽药的检测,参考国家标准与出入境检验检疫行业标准,不同类别兽药分别用HLB、C18、MCX固相萃取小柱进行净化,或直接采取液-液萃取方式净化。以猪肉基质为例,考察了HLB、C18以及MCX固相萃取小柱的净化效果,发现HLB固相萃取小柱仅对部分磺胺类、喹诺酮类、糖皮质激素类、β-受体激动剂类兽药以及罗红霉素、氯霉素回收率高;C18固相萃取小柱平均回收率为67.86%,其中磺胺噻唑、恩诺沙星、双氟沙星、氟哌啶醇、沙美特罗的回收率极低;MCX固相萃取小柱仅对部分β-受体激动剂类兽药回收率高。

根据文献[27],本工作考虑采用基质分散固相萃取的方法进行净化。WondaPak QuEChERS多兽残专用提取包与净化包及Agilent Bond Elut EMR-Lipid萃取包与反萃管是基于基质分散固相萃取法开发的产品,实验比较了这两种方法的净化效果,发现两者对42种兽药化合物均有较好的净化效果,而使用前者回收率稍高于后者,且操作更为方便快捷,因此本实验选取前者作为提取液的净化方法。

2.4 基质效应

基质效应是由基质中的共提干扰物与目标化合物竞争电离所致,对目标化合物的灵敏度、准确度和分析方法的重现性等产生影响。基质效应=基质匹配校准曲线的斜率/溶剂标准校准曲线的斜率[28],比值越接近1,则基质效应越小,反之亦然;若比值在0.8～1.2范围内,则表明基质效应不明显。4种样品的基质效应见表2。结果表明,干肉制品的基质效应大于鲜肉样品,这可能与干肉制品的低含水量有关,且干肉制品的加工工艺复杂,添加的调料可能增大基质干扰,使基质效应明显。4种样品基质中,42种兽药化合物中的38%以上化合物基质效应明显,其中甲睾酮、福莫特罗最为明显,因此采用空白基质匹配标准曲线以降低基质效应的影响。

表 2 42种兽药在4种样品基质中的基质效应

2.5 方法学评价

2.5.1标准曲线、检出限与定量限

配制基质匹配混合标准溶液,在优化的分析条件下进行检测。以目标化合物定量离子的峰面积对含量做标准曲线,4种动物源性食品样品中的基质匹配标准曲线的线性相关系数(R2)均大于0.995。以定量离子的信噪比(S/N)=3和S/N=10分别计算,各兽药化合物在4种动物源性食品样品基质中的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.01～1.68 μg/kg和0.01～5.62 μg/kg。各目标化合物在牛肉基质中的线性关系、LOD和LOQ见表3。

表 3 (续)

Y: peak area;X: content, μg/kg.

2.5.2回收率与精密度

在鲜猪肉、鲜牛肉、猪肉脯、牛肉干4种空白样品中进行3个水平的加标回收试验,每个水平进行6次平行试验,加标水平从小到大标记为Level 1、2、3。在鲜肉样品中,妥洛特罗、班布特罗的添加水平为2、8、40 μg/kg,氟哌啶醇的添加水平为8、20、40 μg/kg,莱克多巴胺、恩诺沙星、马布特罗的添加水平为10、40、100 μg/kg,甲砜氯霉素的添加水平为40、100、200 μg/kg,其余兽药化合物的添加水平均为10、40、200 μg/kg。在干肉制品中,妥洛特罗、班布特罗、氟哌啶醇的添加水平为8、20、40 μg/kg,莱克多巴胺、恩诺沙星、马布特罗的添加水平为10、40、100 μg/kg,其余兽药化合物的添加水平为40、100、200 μg/kg。

结果(见表4)表明,4种基质中所有化合物回收率的RSD均小于15%,满足精密度要求。大多数化合物在4种样品基质的3个添加水平下的平均回收率为65.8%～135.5%,相对标准偏差为0.5%～14.2% (n=6),结果较为理想。对于回收率低于一般定量要求的个别化合物,在实际测定中,可以考虑采用折算的方式对含量进行估算,继而开发单独的方法进行准确定量测定。

表 4 42种兽药在4种样品基质中的加标回收率(n=6)

表 4 (续)

* Nos. are the same as in Table 3.

2.6 实际样品测定

采用本研究建立的分析方法对购自超市的猪肉、牛肉及猪肉脯、牛肉干、手撕牛肉、火腿肠、香肠类肉制品进行检测。其中,猪肉制品的定量测定以猪肉脯基质匹配标准曲线来计算,牛肉制品的定量测定以牛肉干基质匹配标准曲线来计算。在一例牛肉样品中检出环丙沙星,其保留时间差异低于0.5 min,丰度比偏差低于20%,检出含量为53.4 μg/kg,其他样品中均无药物残留检出。虽然代表性基质可能无法完全匹配新类型样品的基质性质,但对于样品中兽药残留的含量测定也具有一定的参考意义。若通过此法筛查出了目标化合物,要增加相应基质匹配标准曲线进行准确定量计算。由于本方法的灵敏度高、检出限低,使用代表性基质匹配标准曲线进行定量计算对于样品中的风险物质监测不会造成假阴性结果。

3 结论

本文利用基质分散固相萃取方法结合高效液相色谱-三重四极杆质谱法,建立了4种代表性的动物源性食品样品基质中13类42种兽药残留的测定方法。该方法快速、简便、灵敏,能够对样品中的目标化合物进行准确的定性和定量分析,适用于动物源性食品样品中多兽药残留的快速检测。