橡胶树可可毛色二孢叶斑病菌生物学特性及药剂筛选试验

戴利铭，刘一贤，施玉萍，李岚岚，张 璇 ，蔡志英

（1.云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100；2.西双版纳职业技术学院，云南 景洪 666100）

天然橡胶为四大工业原料之一，在国防和经济建设中占有关键地位［1］。目前我国天然橡胶生产规模居世界第4位，生产量居世界第6位，而消耗量和进口量却居世界第1位［2］。海南、云南、广东为我国橡胶树主要种植区，由于种植区气候条件温暖湿润，有害微生物繁殖和蔓延致使橡胶树的根茎叶经常遭受多种病虫害的威胁，从而严重制约橡胶产量［3］。叶斑病是橡胶树的毁灭性病害之一，也是限制我国橡胶单产提高的关键因素之一［4］。2016年，本课题组在海南、云南、广东的橡胶种植区资源圃中进行病害调查时发现一种新的橡胶叶受害症状，受害叶初期叶缘或叶尖呈现黄色小点，随后病斑逐渐扩展成近圆形至不规则形、水浸状的灰褐色至褐色病斑，数个病斑最终汇合成大的斑块，叶缘向上卷曲［5］；该病为害幼茎和叶柄，形成黑褐色的条斑，在高温多雨天气情况下引起植株顶部嫩叶枯死、凋落。经形态和分子生物学鉴定该病病原菌为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），为我国橡胶树叶的一种新病害［5］。

目前报道由可可毛色二孢引起的植物病害较为常见，如可可毛色二孢引起的甘薯爪哇黑腐病［6］、高良姜叶枯病［7］、白木香枝枯病［8］、广西桉树溃疡病［9］、桉树枝枯病［10］、毛葡萄穗轴褐腐病［11］、莲雾黑腐病［12］、黑木耳黑皮病［13］等。但迄今为止，国内还没有可可毛色二孢引起的橡胶树叶斑病的相关研究报道，对可可毛色二孢病原菌生物学特性及防控药剂的研究还处于空白。

随着橡胶树种植面积迅速扩大、种植品种趋于单一化，可可毛色二孢引起的叶斑病或许会爆发成灾。目前关于橡胶树主要病害的控制技术主要是药剂防治［14］，本研究通过不同药剂对可可毛色二孢进行室内毒力测定，为可可毛色二孢引起橡胶树叶斑病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株由云南省热带作物科学研究所分离、鉴定、保存。

供试杀菌剂：咪鲜胺450 g/L水乳剂（江苏辉丰农化股份有限公司）、丙环唑250 g/L乳油（先正达苏州作物保护有限公司）、代森锰锌80%可湿性粉剂 （北京燕华永乐生物科技股份有限公司）、百菌清75%可湿性粉剂（世科姆化学贸易有限公司）、甲基硫菌灵70%可湿性粉剂 （山东海迅生物科技有限公司）、三唑酮25%可湿性粉剂（江苏剑牌农化股份有限公司）、异菌脲50%可湿性粉剂（江门方大光明农化新会有限公司）、苯醚甲环唑10%水分散粒剂（先正达苏州作物保护有限公司）、多菌灵50%可湿性粉剂（江苏蓝丰生物化工股份有限公司）、嘧菌酯 250 g/L悬浮剂 （先正达南通作物保护有限公司）。

供试培养基：（1）PDA培养基：葡萄糖1.5 g，马铃薯20 g，琼脂1.8 g，dd H2O定容至100 mL，pH自然；（2）查氏培养基：磷酸氢二钾0.1 g，硝酸钠0.2 g，硫酸镁0.05 g，硫酸铁0.001 g，氯化钾0.05 g，蔗糖3 g，琼脂1.5～2 g，无菌水定容至100 mL。培养基均于121℃灭菌20 min后备用。

1.2 病原菌生物学特性研究

1.2.1 温度对病原菌生长的影响 用打孔器在PDA平板上培养2 d的菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼。将菌饼接种于PDA培养基中央，分别置于 5、10、15、20、25、28、30、35℃ 下的恒温培养箱中培养。

1.2.2 pH对病原菌生长的影响 分别用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调节冷却至60℃左右的PDA培养基，制成pH分别为3、4、5、6、7、8、9的PDA平板，用打孔器打取直径5 mm菌饼接种于不同的pH平板。

1.2.3 病原菌菌丝的致死温度 将病原菌菌株接种到PDA平板上培养2 d后，用打孔器在病原菌菌落边缘打取直径5 mm菌饼，置于放有2 mL无菌水的玻璃试管（已灭菌），分别于40、45、50、51、52、53、54、55、60℃恒温水浴锅中处理10 min，迅速冷却，无菌条件下将菌饼取出接种于PDA平板中央，以室温中放置的试管作为对照，逐日观测菌丝生长情况。

1.2.4 碳源对病原菌生长的影响 以蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、淀粉、果糖、甘油11种碳源分别代替Czapek培养基中的蔗糖。

1.2.5 氮源对病原菌生长的影响 以色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、硫酸铵、酪氨酸、丙氨酸、蛋白胨、胱氨酸、甘氨酸11种氮源分别代替Czapek培养基中的硝酸钠，配制不同氮源培养基。

1.2.6 光照对病原菌生长的影响 设置24 h黑暗、24 h光照、9 h黑暗/9 h光照3种光照条件，将病原菌接种到PDA培养基上，观察菌落生长情况。

上述处理均重复3次，培养36 h后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.3 杀菌剂对病原菌的室内毒力测定

将杀菌剂用无菌水配制成浓度不同的平板（表1），以不含药剂的平板为对照。打取病原菌菌饼接种至杀菌剂平板中央，每个浓度接3个平板，重复3次。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落直径的平均值及抑制率［15-16］：

表1 各供试杀菌剂的有效浓度

抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.5 cm）×100

毒力回归方程以浓度的对数值（x）和平均抑菌率的机率值（y）表示，比较供试9种杀菌剂对供试菌株的毒力大小［16］。根据求得的毒力回归方程，分析病原菌对杀菌剂的敏感性［16-17］。

2 结果与分析

2.1 病原菌生物学特性研究

2.1.1 温度对病原菌生长的影响 病原菌菌丝体生长特性测定结果（图1）表明，可可毛色二孢菌丝体在15～40℃之间都能生长，25～35℃为其适宜的生长温度范围，培养36 h后菌落直径在56.36～73.23 mm之间。从图1可以看出，可可毛色二孢最适生长温度为30℃，培养36 h后菌落直径达到73.23 mm。高于35℃时菌丝体比较敏感，低于15℃或高于40℃时菌丝体生长受到抑制或无法正常生长。

图1 温度对病原菌菌丝体生长的影响

2.1.2 pH对病原菌生长的影响 在供试的所有pH值（3～9）下可可毛色二孢菌丝体均能生长，最适宜菌丝体生长的pH为6，培养36 h后菌落直径达到67.68 mm。由图2可知，该菌生长的pH较广，在酸性、中性、弱碱性条件下生长都较为良好。

图2 pH对病原菌菌丝体生长的影响

2.1.3 病原菌菌丝的致死温度 以在室温下培养的菌丝体作对照，设置9个温度对可可毛色二孢菌丝体进行处理，在40、45、50、51、52℃处理10 min后仍然能在PDA平板上正常生长，但是在53℃及以上温度处理10 min后不能生长。由此表明，53℃10 min为可可毛色二孢菌丝体的致死温度。

2.1.4 碳源对病原菌生长的影响 可可毛色二孢在供试的11种碳源上均可生长，但对不同碳源利用程度存在差异（图3），对葡萄糖和果糖利用率最高，菌丝生长速度最快，培养36 h后菌落直径分别达76.34 mm和68.42 mm，在含有半乳糖和蔗糖的查氏培养基上生长状况良好；在含麦芽糖、木糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、乳糖的查氏培养基上生长状况一般，菌落直径在43.20～52.52 mm。在不含任何碳源的查氏培养基上生长时，菌丝体生长快但稀薄。

图3 碳源对病原菌菌丝体生长的影响

2.1.5 氮源对病原菌生长的影响 在含有12种不同氮源的查氏培养基上，可可毛色二孢菌生长状况差异较大，在含酵母浸膏、牛肉浸膏的查氏培养基上生长较快且菌丝生长旺盛，培养36 h后菌落直径分别达70.25 mm和72.30 mm。该菌在不含任何氮源的培养基上生长快但生长不旺盛，而在含有尿素的查氏培养基上生长最慢，在含有丙氨酸的查氏培养基上生长快但菌丝极其稀薄（图4）。

2.1.6 光照条件对病原菌生长的影响 全光条件下菌丝体生长速率最快，但菌丝稀薄。完全黑暗条件下生长较慢，但是菌丝长得茂盛。菌丝体在光/暗交替条件下生长较全光照条件下慢（图5）。

2.2 供试杀菌剂对可可毛色二孢的室内毒力测定

2.2.1 杀菌剂对可可毛色二孢EC50值的比较分析 由表2可知，对可可毛色二孢毒力作用最强的是多菌灵，其EC50小于0.1 μg/mL；其次为丙环唑、甲基硫菌灵、苯醚甲环唑、异菌脲，其 EC50分别为 0.2176、0.2019、0.3566、0.5146 μg/mL；毒力作用一般的为百菌清、咪鲜胺，平均 EC50值分别为 6.003、1.5202 μg/mL；代森锰锌、嘧菌酯两种药剂对供试病原菌的毒力作用较差，其平均EC50值分别为36.1659、75.7705 μg/mL；三唑酮对病原菌的毒力作用最差，平均EC50值为102.0939 μg/mL。由此表明，10种供试杀菌剂对可可毛色二孢的毒力存在明显差异，其中多菌灵的抑菌效果最好，其次为甲基硫菌灵。

2.2.2 杀菌剂对可可毛色二孢EC75值的比较分析 由表2可知，10种供试药剂可分为4类，第1类是多菌灵，抑菌效果最好，平均EC75值小于0.1 μg/mL；第2类是异菌脲、甲基硫菌灵，平均EC75小于1 μg/mL，分别为0.9627、0.31703 μg/mL；第3类是丙环唑、苯醚甲环唑、百菌清、咪鲜胺、代森锰锌，平均EC75值在1.5933～162.7796 μg/mL之间，抑菌效果较差；第4类为嘧菌酯、三唑酮，平均EC75值为516～607.4353 μg/mL，说明该药剂对该病菌基本没有抑制效果。

表2 供试杀菌剂对可可毛色二孢的毒力测定结果

2.2.3 可可毛色二孢对杀菌剂的敏感性比较分析 毒力回归曲线的斜率与病原菌对杀菌剂的敏感性成正比。从表2毒力回归方程中可以看出，可可毛色二孢对杀菌剂的敏感性斜率范围在0.3496～4.0790之间，其中多菌灵对可可毛色二孢的斜率值最大，为4.0790；其次为甲基硫菌灵，斜率组为3.4432；而百菌清和咪鲜胺的斜率值最小，分别为0.4706和0.3496。表明在供试的杀菌剂中，可可毛色二孢对多菌灵最敏感，其次为甲基硫菌灵，而对百菌清和咪鲜胺最不敏感。

3 结论与讨论

热带、亚热带地区橡胶树资源丰富，而高温高湿的气候也使微生物快速生长繁殖，导致橡胶树的根、茎、叶部病害发生严重。本课题组从广东、海南和云南省等多个苗圃橡胶叶斑病上分离得到一种橡胶树新致病菌——可可毛色二孢［5］。为对该病的防治提供理论指导，本课题组对可可毛色二孢的生物学特性进行初步研究，发现25～35℃适宜该病原菌菌株生长，30℃为最适生长温度；当温度高于40℃时或低于15℃，菌丝体的生长受到抑制，这与文新、薛振南等［18-19］报道的肉桂枝枯病菌可可毛色二孢菌相似；可可毛色二孢菌丝体致死温度是53℃ 10 min，与薛振南等［19］报道的可可毛色二孢相似，说明该菌是一种偏好高温适生菌；该菌生长的pH范围与薛振南等［19］报道相同，在pH 3.0～9.0范围内均能生长，以pH 5.0～6.0生长最好；可可毛色二孢对碳源和氮源要求不严格，对各种碳源和氮源的利用率都很高；其中碳源以葡萄糖利用率最高，这与史国英等［20］报道的毛葡萄穗轴褐腐病可可毛色二孢菌相似，而与车建美等［21］报道的莲雾黑腐病病原菌可可毛色二孢菌不同（最佳碳源为甘露醇）；氮源以牛肉浸膏利用率最高，这与董章勇等［22］报道的沙田柚果腐病可可毛色二孢不同（最佳氮源为甘氨酸），但这两个来源的可可毛色二孢都无法利用尿素。研究报道的可可毛色二孢特性与本试验所测部分结果一致、部分结果不同，这可能与不同地区所分离到的菌株的生物学特性、抗逆性、致病性以及菌落形态等方面均存在差异有关。

目前报道由可可毛色二孢引起的植物病害较为常见，但与其相应的毒力实验国内相关报道较少。邹东霞等报道8种杀菌剂对桉树枝枯病病原菌室内毒力测定，发现对可可毛色二孢抑菌效果最好的是25%咪鲜胺，EC50值为0.03 mg/L［23］；宋雅琴等为筛选适合防治葡萄溃疡病的杀菌剂，采用菌丝生长速率法测定了目前生产中常用的25种杀菌剂对葡萄溃疡病菌毛色二孢的抑制效果，发现丙森锌可湿性粉剂、多菌灵可湿性粉剂对毛色二胞菌丝生长的抑制率可达100%［24］。唐利华等报道10种杀菌剂对广西杧果流胶病菌的室内毒力测定，结果发现，多菌灵对杧果流胶病3种主要病原菌可可毛色二孢、七叶树壳梭孢和小新壳梭孢的抑制效果最好［25］。本研究以10种供试药剂对可可毛色二孢菌丝体生长的EC50值和毒力回归方程斜率进行分析，发现多菌灵、丙环唑、甲基硫菌灵、苯醚甲环唑、异菌脲这5种药剂对橡胶树可可毛色二孢叶斑病的EC50平均值在0.0675～0.5146 μg/m之间，说明这5种药剂对橡胶树可可毛色二孢叶斑病的抑菌效果较好，其中多菌灵的EC50值最小，且在所有药剂实验中对病原菌最敏感，这与唐利华等和宋雅琴等的报道［24-25］相似。但对橡胶树褐根病的抑制效果，多菌灵抑制效果最差［26］。多菌灵是一种具有保护和治疗功能的苯并咪唑类杀菌剂，常用于防治杧果炭疽病和蒂腐病［27-28］，其作用机理是阻止β-微管蛋白与α-微管蛋白组装成微管或使已组装的微管解聚，导致纺锤体不能形成，进而阻止真菌细胞的有丝分裂，但文献报道长期大量使用药剂多菌灵容易产生抗药性［29-30］。仅从毒力测定结果来看，多菌灵是用来防治可可毛色二孢叶斑病最好的药剂，丙环唑、甲基硫菌灵、苯醚甲环唑等可作为交替使用的农药品种。由于该实验药剂筛选是在室内完成，对橡胶树可可毛色二孢叶斑病的田间实际防治效果还需做进一步的田间药效实验，且还需要考虑各种杀菌剂的成本，对植物和环境的影响等方面进行综合比较，以实现经济合理地使用杀菌剂［31］。

本实验采用实验室常规方法研究橡胶树可可毛色二孢叶斑病菌的生物学特性，研究发现该菌生长适应性极强，最适生长温度为30℃；最适生长pH为6；致死温度为53℃处理10 min，对碳源和氮源要求不严格；采用菌丝生长速率法测定了10种杀菌剂对该病原菌的室内毒力作用，发现对可可毛色二孢毒力作用最强、最敏感的药剂为多菌灵。