康宁霉素对臭椿苗期致病菌的离体抑菌活性

柳婷婷 ，刘南南 ，王桂清

（1.聊城大学农学院，山东 聊城 252059；2.聊城市农业委员会，山东 聊城 252000）

木霉菌（Trichodermaspp．）是自然界广泛分布的一种真菌，属半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目丛梗孢科木霉属，广泛存在于土壤环境中，在植物根基土壤、种子、叶围和球茎等生态环境中也大量存在［1］，目前其对18个属29个种以上的病原真菌有拮抗作用，具有较高的生防价值［2］，在农业和园林生产中具有广泛的应用。康宁霉素（Trichokonins，TKS）是长枝木霉的一种次级代谢产物，能够有效抑制革兰氏阳性细菌和多种植物病原真菌，具有广谱杀菌性［3］。臭椿（Ailanthus altissima Swingle）根系发达、生长迅速，易繁殖［4］，同时具有抗旱、耐盐碱、耐贫瘠等特点，是理想的行道树。但臭椿幼苗小叶基部腺齿不发达，对病虫害的防御力低，易受病虫害侵染，病害发生严重，甚至大面积死亡，因此解决臭椿苗期病害问题迫在眉睫。臭椿苗期病虫害主要有锈病、白粉病、炭疽病、腐烂病等［5］，经采样、分离、鉴定，发现引起臭椿苗期病害的主要致病菌有腐皮镰刀菌（Fusarium soiani）、木贼镰刀菌（F. equiseti）、棒状拟盘多毛孢菌（Pestalopsis clavispora）和极细链格孢菌（Alernaria tenuissima）4种（另文发表）。目前关于生物防治臭椿苗期病害的研究较少，也未见用木霉及其代谢产物防治臭椿病害或诱导促生长作用的报道。因此，自2014年开始聊城大学农学院植物病理研究室对臭椿苗期病害致病菌进行分离鉴定及室内药效试验。本试验以康宁霉素水溶剂为研究对象，以苯醚甲环唑、多菌灵、苦参碱和霜霉立克等药剂为阳性对照，以臭椿苗期病害的主要致病菌为靶标，探究康宁霉素对致病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用，以期明确康宁霉素对真菌的抑菌效果，为其防治臭椿苗期病害提供理论依据，并为其作为生防制剂在园林树木生物防治中的推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为引起起臭椿苗期病害的4种主要病原菌，分别为木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌、棒状拟盘多毛孢菌和极细链格孢菌，保存于聊城大学农学院病理研究室。采用PDA培养基于25（±1）℃的恒温培养箱内12 h光照/12 h黑暗培养7 d，用打孔器制取直径0.7 cm的菌饼接种备用。

供试药剂为14.39 mg/mL康宁霉素水溶剂和60%多菌灵可湿性粉剂、20%苯醚甲环唑微乳剂、0.36%苦参碱可溶性液剂、10.3%霜霉立克乳油4种对照农药。

菌丝生长抑制试验药液的配制：用无菌水将康宁霉素、多菌灵、苯醚甲环唑、苦参碱和霜霉立克分别配制成终浓度为25、50、100、200、400 mg/L，6.25、12.5、25、50、100 mg/L，25、50、100、200、400 mg/L，4、8、16、32、64 mg/L，20、40、80、160、320 mg/L，按浓度由低到高编号为1、2、3、4、5，备用。

孢子萌发抑制试验药液的配制：用无菌水将康宁霉素终浓度配制成17.5、35、70、140、280 mg/L，其他4种农药配制终浓度同菌丝生长抑制试验药液浓度。

1.2 生物活性测定

以菌丝生长速率法［6-7］测定康宁霉素和对照药剂对臭椿幼苗4种致病菌的抑制作用。所用培养基为PDA培养基，菌饼直径0.7 cm，每皿1块，3次重复，25（±1）℃光照培养箱中培养。待对照菌落直径大约在3 cm以上时，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100

以孢子萌发法［8］测定康宁霉素和4种其他药剂对孢子萌发的抑制作用。以只加无菌水为空白对照，3次重复，12 h观察结果，计算孢子萌发抑制率：

1.3 数据处理

各药剂浓度进行对数转换，与对应的防效机率值作回归分析，试验数据采用Microsoft Excel软件进行统计整理，经DPSv7.05统计软件进行方差分析及显著性检验，求得相关系数、线性回归方程、各药剂处理的EC50值及其95%置信限，建立毒力回归曲线等。

2 结果与分析

2.1 康宁霉素对致病菌菌丝生长的抑制作用

2.1.1 康宁霉素对致病菌菌丝生长的抑制作用 康宁霉素及对照药剂对4种致病菌菌丝生长抑制率如图1所示。康宁霉素对4种致病菌菌丝生长均有抑制作用且随着药剂浓度的提高，抑制率增大；相同浓度下，康宁霉素对棒状拟盘多毛孢菌抑制率最高，对木贼镰刀菌抑制率最低，在400 mg/L时抑制率分别为86.37%、54.36%，前者是后者的1.59倍。以对腐皮镰刀菌菌丝生长抑制作用为例，康宁霉素抑制作用在一定浓度范围内先随浓度升高直线上升，达到编号2浓度（50 mg/L）时出现转折点，增长趋势趋于平缓。多菌灵抑制作用较强，最高浓度（100 mg/L）时抑制率接近100%，而霜霉立克抑制作用一直较差，在供试浓度下抑制率均低于52%。

2.1.2 康宁霉素对致病菌菌丝生长的抑制效果 康宁霉素及对照药剂对4种致病菌的菌丝生长的抑制效果见表1。康宁霉素对棒状拟盘多毛孢菌的EC50最小、为32.97 mg/L，对极细链格孢菌、腐皮镰刀菌和木贼镰刀菌的EC50依次增大，分别为95.66、143.91、297.28 mg/L，说明康宁霉素对棒状拟盘多毛孢菌的菌丝生长抑制效果较为显著。

图1 5种药剂对致病菌菌丝生长的抑制率

以对腐皮镰刀菌菌丝生长抑制效果为例，康宁霉素的EC50为143.91 mg/L，是苦参碱的58.26倍、多菌灵的8.94倍、苯醚甲环唑的2.02倍，即其药效仅为苦参碱的1.72%、多菌灵的11.19%、苯醚甲环唑的49.51%，说明康宁霉素对腐皮镰刀菌菌丝生长的抑制作用弱于多菌灵、苦参碱和苯醚甲环唑；康宁霉素的EC50是霜霉立克的0.39倍，即其药效为霜霉立克的2.56倍，说明康宁霉素对腐皮镰刀菌菌丝生长的抑制作用优于霜霉立克。

2.2 康宁霉素对致病菌孢子萌发的抑制作用

2.2.1 康宁霉素对致病菌孢子萌发的抑制作用 康宁霉素及对照药剂对4种致病菌孢子萌发抑制率如图2所示。康宁霉素对4种致病菌孢子萌发均有抑制作用，对棒状拟盘多毛孢菌孢子萌发抑制率最高，在280 mg/L时，对棒状拟盘多毛孢菌、极细链格孢菌、木贼镰刀菌、腐皮镰刀菌的孢子萌发抑制率分别为82.85%、71.33%、67.74%、75.01%。

以对腐皮镰刀菌孢子萌发抑制效果为例，5种制剂对腐皮镰刀菌孢子萌发均有抑制作用，且随着药剂浓度的增大，相对抑制率相应增大。在试验浓度条件下，康宁霉素对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制率基本高于对应编号浓度下苦参碱和霜霉立克对其抑制率。

2.2.2 康宁霉素对致病菌孢子萌发的抑制效果 康宁霉素及对照药剂对4种致病菌的孢子萌发的抑制效果见表2。康宁霉素对棒状拟盘多毛孢菌孢子萌发的EC50最小，为47.99 mg/L，对极细链格孢菌、腐皮镰刀菌和木贼镰刀菌的EC50依次增大，分别为62.01、76.20、111.19 mg/L，说明康宁霉素对棒状拟盘多毛孢菌孢子萌发的抑制作用最强。

在对腐皮镰刀菌的孢子萌发抑制效果上，康宁霉素的EC50为76.20 mg/L，是多菌灵的4.62倍、苦参碱的3.55倍、苯醚甲环唑的1.04倍、霜霉立克的0.75倍，即其药效为多菌灵的21.64%、苦参碱的28.20%、苯醚甲环唑的95.73%、霜霉立克的1.33倍，说明康宁霉素对腐皮镰刀菌孢子萌发的抑制作用与苯醚甲环唑相近、优于霜霉立克，不及多菌灵和苦参碱。

表1 5种制剂对致病菌菌丝生长的抑制效果

图2 5种药剂对致病菌孢子萌发的抑制率

综上，康宁霉素对4种致病菌菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用，比较EC50，总体而言康宁霉素对致病菌孢子萌发的抑制效果优于对菌丝生长的抑制效果。

3 结论与讨论

康宁霉素对臭椿苗期病害的不同致病真菌抑制效果不同，对棒状拟盘多毛孢菌的抑制效果最好，最高浓度时对菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为86.37%、82.85%；对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为32.97、47.99 mg/L，对木贼镰刀菌抑制效果最差，对菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为297.28、111.19 mg/L，说明康宁霉素的抑制作用具有一定的选择性。

对多数致病菌来说，以腐皮镰刀菌为例，康宁霉素对其菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为 143.91、76.20 mg/L，苦参碱为 2.47、21.49 mg/L，多菌灵为16.10、16.49 mg/L，苯醚甲环唑为71.25、72.95 mg/L，霜霉立克为368.03、101.18 mg/L，康宁霉素的EC50均高于多菌灵和苦参碱，低于霜霉立克，即其抑菌效果低于多菌灵和苦参碱，优于霜霉立克，说明康宁霉素对引起臭椿苗期病害的4种致病菌有良好的防治效果。

康宁霉素对多数致病菌孢子萌发的EC50均小于对应致病菌菌丝生长的EC50，说明康宁霉素对致病菌孢子萌发的抑制效果优于其对菌丝生长的抑制效果。该结论为康宁霉素用于病害流行的防治适期提供了理论基础。

抗生作用是木霉菌发挥生物防治作用的重要机制之一，许多木霉在代谢过程中可以产生抑制病原菌的拮抗性化学物质，包括抗生素类和一些酶类，如木霉素、胶霉素、绿木霉素、抗菌肽等。木霉菌产生的次生性代谢产物广泛应用于植物病害防治，在生物及其医药领域也有一定的应用价值［9］，其对很多病原菌有显著的抑制作用［10］。康宁霉素是由康宁木霉（现已更名为长枝木霉［11-12］）生防菌SMF2的固体培养物中分离提纯获得的一类Peptaibols抗菌肽，解树涛等［13］证明康宁霉素对细菌有抑菌活性，对革兰氏阳性细菌的作用大于对革兰氏阴性细菌的作用。胡明江等［14］利用长枝木霉SMF2分生孢子制剂进行了防治大白菜软腐病的田间药效试验，发现SMF2分生孢子制剂对大白菜软腐病具有较好的防治效果，明显优于大面积推广应用的农用链霉素，且持效期比农用链霉素长。

表2 5种制剂对致病菌孢子萌发的抑制效果

解树涛等［13］证明长枝木霉对真菌有较为广泛的抑菌谱；常媛等［15］在八宝景天根际土壤中分离得到的一株优势长枝木霉对细链格孢菌等3种土传病害病原真菌均有较明显的拮抗作用；张瑾等［16］研究表明长枝木霉菌对苹果树腐烂病菌等12种植物病原真菌的生长均有不同程度的抑制作用，其抑菌作用机制主要是竞争作用；陈凯等［17］认为长枝木霉的代谢产物Bisorbicillinoids具特异的生物活性，可致辣椒疫霉菌的菌丝畸形，是一种潜在的抗真菌物质。

研究证明康宁霉素具有促进植物生长及诱导抗性作用，在一定浓度内可促进皂荚种子的萌发，有利于国槐幼苗根系的伸长，侧根的形成与生长以及根系系统的稳固程度［18］；可以诱导烟草产生系统抗性，降低烟草花叶病毒的侵染［19］；可通过促生作用和诱导抗性防治大白菜软腐病［20］。木霉菌株的胞外代谢产物对人、畜为实际无毒，因此可作为绿色生物农药广泛使用。本课题组将扩大康宁霉素抑菌种类的研究，明确其抑菌谱；同时在长枝木霉及其代谢产物的抑菌机理、对园林植物的促生长作用及诱导抗性等方面继续加以深入研究。