一种新型木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

李 琦，成莉凤，段盛文，冯湘沅，郑 科，杨 琦，刘志远，彭源德

(1.中国农业科学院 麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖南利尔康生物股份有限公司，湖南 岳阳 414100；3.湖南农业大学 植物保护学院，湖南 长沙 410128)

木聚糖是一种带有多种取代基的复杂多糖，其主要成分是D-木糖。根据糖苷键的类型不同，木聚糖可分为β-1，4-木聚糖和β-1，3-木聚糖[1]。自然界中的木聚糖多为在主链和侧链上含有不同大小的取代基团的异质多糖，主链上最常见的取代基团是O-乙酰基、L-阿拉伯糖基和O-甲基-葡萄糖醛酸基等[2]。由于木聚糖化学组成与结构的异质性，决定了其彻底降解需要内切β-1，4-木聚糖酶、外切β-1，4-木聚糖酶、木糖苷酶等一系列的酶协同作用[3]。

木聚糖酶也叫内切木聚糖酶或β-1，4-内切木聚糖酶 (endo-1，4-β-xylanase，EC 3.2.1.8)，以内切方式作用于木聚糖分子中β-1，4-木糖苷键，生成木二糖及木二糖以上的寡聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖[4]。目前，其已被广泛应用于造纸、饲料、纺织、能源等行业[5-6]。尤其在植物韧皮脱胶中，木聚糖酶作为去除附着在纤维表面或镶嵌在纤维内部的半纤维素木聚糖的关键因子，是脱胶酶制剂中不可或缺的成分[7]。

国内外有关产木聚糖酶的微生物报道很多，比如：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GN156、链霉菌(Streptomycesturgidiscabies)C56、类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)JDR-2等[8-10]。近年来，随着基因工程和蛋白质技术的发展，利用基因重组技术克隆和表达了一系列来自细菌或真菌的木聚糖酶基因[11]。最为常见的表达方式是原核表达，其操作简单、代时短，易于高密度培养，但大多数E.coli基因工程菌的木聚糖酶表达量往往比在亲本中产酶量低，且表达产物易存在于细胞质或周质腔内形成包涵体，需进行破壁才能提取，限制了酶在工业中的应用。近年来采用了酵母、霉菌等真核生物使木聚糖酶基因高效分泌表达[12]。目前，极端嗜热菌产木聚糖酶是研究热点，其产量高，耐热性好，具有重要的工业应用前景[13]。

中国农业科学院麻类所农产品加工微生物遗传改良与应用团队长期从事麻类脱胶酶学研究，在工程酶项目组对耐热的木聚糖酶基因原核表达的基础上[14]，根据一种新型木聚糖酶基因xynA(GenBank登录号：U57819)的成熟蛋白编码序列构建真核表达体系，进而对表达产物定性和定量分析，为该木聚糖酶的功能研究和大规模工业化应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基 YPD培养基、BMMY培养基、BMGY培养基。

1.1.2 引物 5′AOX引物序列：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；3′AOX引物序列：GGATGTCAGAATGCCATTTGC。

1.1.3 主要试剂TaqDNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；兔抗his标签、羊抗兔、酵母基因组DNA快速抽提试剂盒(SK8228)、TCA沉淀试剂盒沉淀蛋白(BSP012)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；所有引物合成、基因合成以及DNA 序列测定均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 基因合成 合成xynA(GenBank登录号：U57819)中编码成熟木聚糖酶的基因序列，正向序列添加GCgaattc(酶切位点EcoR Ⅰ)，反向序列添加ATgcggccgc(酶切位点NotⅠ)。

1.2.2 重组质粒 pPICZαA-xynA构建及线性化 将包含木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynA的PCR产物和质粒pPICZαA分别用EcoR Ⅰ和NotⅠ进行双酶切，37 ℃保温3 h后，分别用EasyPure PCR Purification Kit进行纯化后，用T4DNA 连接酶将2个片段进行连接，将连接液转化至感受态细胞TOP10，将转化液涂布到含Amp 25 μg/mL和Kan 50 μg/mL的LB平板上。挑取单克隆进行菌落PCR和质粒酶切鉴定，目的片段大小正确为阳性克隆。从阳性菌落提取质粒，送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，确定碱基无突变，即成功获得pPICZαA-xynA。SacⅠ酶切重组质粒pPICZαA-xynA，回收线性化后的正确DNA 片段。

1.2.3 毕赤酵母X33感受态细胞的制备和转化 挑取YPD平板上X33菌株接种进入50 mL YPD培养基，30 ℃，220 r/min培养至OD600为1.3～1.5，冰浴30 min。4 ℃，1 500 r/min，离心5 min沉淀细胞，于10 mL冰冷的无菌去离子水悬浮。4 ℃，1 500 r/min，离心5 min沉淀细胞，于5 mL冰冷的无菌去离子水悬浮。4 ℃，1 500 r/min，离心5 min沉淀细胞，于2 mL冰冷的无菌1 mol/L 山梨醇悬浮(该步骤重复1次)，分装备用。取8 μL线性化的单拷贝质粒加入80 μL X33感受态细胞并轻轻混匀，转入2 mm预冷电转杯，冰上放置5 min，放入电转仪，电击，电压：1 500 V，电击时间4.8 ms，电击完成后，立即加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇，混匀后转移到1.5 mL离心管中，30 ℃，静置培养1～2 h，取100 μL菌液涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板。将单菌落用无菌水充分打散、混匀，稀释1 000 倍，再分别取100 μL菌液涂布于含0.8 mg/mL Zeocin的YPD平板。

1.2.4 阳性克隆的PCR鉴定 参照酵母基因组DNA快速抽提试剂盒说明书提取酵母基因组DNA。使用载体通用引物5′AOX和3′AOX引物序列，以pPICZαA-xynA质粒为模板进行PCR扩增。PCR参数设置：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存备用。

1.2.5 木聚糖酶序列分析 根据木聚糖酶基因测序结果，翻译成蛋白质序列，利用NCBI中的Blast进行序列比对，找到相似性较高的微生物来源的木聚糖酶氨基酸序列，利用MEGA 6.0软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.2.6 X33/pPICZαA-xynA分泌表达 挑选7 个高浓度抗生素筛选后的单克隆，于2.5 mL YPD液体培养基，30 ℃，220 r/min培养12 h。配制BMGY(pH值6.0)培养基，分别接种200 μL菌液(包括X33/pPICZαA空载)，30 ℃，220 r/min培养至OD600达4.7，离心，换成培养基BMMY(pH值6.0)，每12 h加入0.5%甲醇进行诱导，诱导温度29 ℃，220 r/min诱导表达72 h，测定粗酶液的木聚糖酶活力。

1.2.7 Western Blot 鉴定木聚糖酶 SDS-PAGE样品制备：取600 μL诱导72 h的菌悬液离心收获上清，取200 μL上清，采用生工TCA沉淀试剂盒沉淀蛋白，最终蛋白重悬液体积为20 μL。X33/pPICZαA-xynA转化子分别记为：X33/pPICZαA-H1～H7，阴性对照为X33/pPICZαA。SDS-PAGE电泳：浓缩胶5%，分离胶12%。取20 μL上样。浓缩胶在80 V条件下电泳30 min；分离胶在120 V条件下电泳60 min。考马斯亮蓝法染色。Western Blot流程：①转膜：湿转，250 mA，2 h；②封闭：5%的脱脂奶粉，37 ℃ 缓慢振荡1 h；③孵育一抗(兔抗his标签)：1∶500稀释，37 ℃ 缓慢振荡60 min；④孵育二抗(羊抗兔)：1∶8 000稀释，37 ℃ 缓慢振荡60 min；⑤显色：TMB显色[15]。

1.2.8 木聚糖酶活力测定 取发酵液10 mL，在4 ℃条件下，3 000 r/min离心10 min，上清液即为酶液。准确吸取1.0 mL适当稀释的酶液和2.0 mL 0.5%的木聚糖底物(缓冲体系为pH值6.0，0.05 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠)，60 ℃水浴准确反应10 min，沸水浴10 min终止反应。同时，将1.0 mL相同酶液在沸水浴中灭活5 min，后续做相同处理为空白对照，测定OD540。酶活力定义：在适当反应条件下，每分钟释放出1 μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量为1 个酶活力单位，以U表示[16]。

2 结果与分析

2.1 质粒SacⅠ线性化及转化

对SacⅠ酶切后的线性质粒进行检验。图1结果表明，其片段约为4 646 bp(泳道2)，这与预期的载体3 593 bp 和目的基因1 053 bp之和基本一致。将正确的线性化的重组子转化到毕赤酵母X33。

M.从上到下依次为20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp；1.未线性化pPICZαA-xynA质粒；2.线性化的pPICZαA-xynA质粒。M.From top to bottom 20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp; 1.Unlinearized pPICZαA-xynA plasmid; 2.Linearized pPICZαA-xynA plasmid.

2.2 菌落PCR鉴定

随机挑取7 个单菌落，以质粒DNA为模板，进行PCR鉴定。图2结果表明，7 个转化子的PCR产物均有一特异条带(约1 541 bp)，其分子量大小与预计大小相同。

M.20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp；P.阳性对照；L-1～L-7.7个转化子的PCR产物。M.20 000，10 000，7 000，5 000，4 000，3 000，2 000，1 500，1 000，750，500，400，300，200，75 bp; P.Positive control；L-1-L-7.PCR products of 7 transformers.

2.3 木聚糖酶序列分析

通过生物信息学软件分析，该木聚糖酶含有典型的糖苷水解酶11类催化结构域(图3)，成熟蛋白的预测分子量为38.6 ku，等电点为6.86。用MEGA 6.0软件对不同微生物来源木聚糖酶蛋白质序列进行聚类分析。图4结果表明，在进化树中，本研究的木聚糖酶与来源于Orpinomycessp. FCT 2进化的木聚糖酶遗传距离最近，处于同一分支上。

图3 木聚糖酶的结构域分析Fig.3 Analysis on structural domain of xylanase

图4 不同来源木聚糖酶序列的系统发育树Fig.4 Neighbor-Joining tree constructed showing phylogenetic relationships amongxylanase sequences from different microorganisms

2.4 X33/pPICZαA-xynA分泌表达检测

2.4.1 木聚糖酶活力检测 取成熟的发酵液，测定胞外木聚糖酶活力。由表1可知，在该测定条件下，7个基因工程菌的胞外木聚糖酶活力均≥300 U/mL，其中，L-7测得的果胶裂解酶活力最高，达487.2 U/mL。

表1 基因工程菌种的木聚糖酶活力检测Tab.1 Detection on xylanase activity secreted by genetic-engineering strains U/mL

2.4.2 SDS-PAGE分析 取诱导72 h后的胞外蛋白进行电泳。图5结果表明，7 个基因工程菌种的胞外蛋白特征谱带大小均约为45 ku，比目标XynA蛋白预期大小38.6 ku略大。

M.蛋白质分子量标准；N.阴性对照；H-1～H-7.7 个基因工程菌的胞外诱导蛋白。图6同。M.Protein molecular weight ledders;N.Negative control；H-1-H-7.Extracellular inducible proteins of 7 genetically engineered bacterias.The same as Fig.6.

2.4.3 Western Blot分析 对基因工程菌的胞外蛋白进一步Western Blot分析，图6结果表明，与阴性对照比较，H-1～H-7均在45～60 ku附近有明显条带信号。其分子量也比目标XynA蛋白预期的38.6 ku略大，推测其可能是发生了糖基化或其他翻译后修饰。

图6 基因工程菌的胞外木聚糖酶Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis of extracellular xylanasesfrom genetic-engineering strains

3 讨论与结论

木聚糖酶在工业中的应用越来越广泛，但是应用于不同领域的木聚糖酶需具有不同的酶学性质，不同家族的木聚糖酶的理化性质、结构、作用方式和底物特异性有很大的区别。纸浆工业中，应用较多的为耐热的高活性的碱性木聚糖酶；食品和饲料加工业中，应用较多的则为酸性木聚糖酶[17-18]。关于微生物木聚糖酶的耐热性和耐碱性的研究较多，但是酸性和中性木聚糖酶的研究报道较少。本研究对一个新型的第11 家族的木聚糖酶基因构建了真核表达体系，初步获得的胞外酸性偏中性木聚糖酶活力最高达487.2 U/mL，是同类基因其他胞外分泌量的8～10 倍[19-21]。其表达产物分子量比目标XynA蛋白预期的(38.6 ku)略大，推测其可能是发生了糖基化或其他翻译后修饰[22]，还有待进一步证实。

通过优化发酵条件，可以大幅度提高木聚糖酶的产酶量。王雅珍等[23]通过对1株青霉菌的液体发酵条件优化，结果表明产木聚糖酶酶活力达到1 808 U/mL，是初筛酶活的361.6%。滕超等[24]对1株真菌嗜热踝节菌的木聚糖酶产酶条件进行优化，结果表明，发酵培养第7天产酶量达3 026.65 U/mL，是初始酶活的3.15倍。本研究后续将会尝试优化基因工程菌种X33/pPICZαA-xynA的产酶条件，有望大幅度提高木聚糖酶的分泌量。

虽然市场上现有很多木聚糖酶的相关商品，但是具有竞争力的产品大部分来自外国公司(如杰能科诺、诺德和诺维信等)，国内仍需自主大力开发各种木聚糖酶新产品[16]。

本研究对一种新型G11木聚糖酶基因构建了真核表达体系。一种新型木聚糖酶基因在毕赤酵母中获得可溶性高效表达，为下一步获取高纯度木聚糖酶研究酶学性质、催化分子机理以及大规模研制木聚糖酶制剂奠定了坚实的基础。