应用功能微生物菌剂提高酱香白酒窖面酒质量的研究

卢 君，山其木格，王 丽，孟天毅，张忠奎，李长文，

（1.天士力控股集团有限公司研究院，天津300410；2.贵州国台酒业有限公司，贵州仁怀564501）

酱香型白酒以其感官风味特征的丰富性，深受消费者的喜爱。酱香型白酒“三高三长”的工艺，即高温制曲、高温堆积发酵、高温馏酒、基酒生产周期长、基酒酒龄时间长、大曲储存时间长，以及参与其中的微生物菌群的作用，决定了酱香白酒物质组成的复杂性和感官风格的丰富性[1]。

酱香型白酒生产过程中主要有3种典型体的基酒，分别为窖面酒、窖底酒和醇甜酒[2]。窖面酒酱香突出、曲香明显、略涩、后味绵长；醇甜酒酱香突出，具有醇甜味，后味爽净；窖底酒具有部分浓香型酒风格，酱香明显，浓厚丰满[3]。其中窖面酒主要体现酱香和曲香的风格，对于酱香白酒主体香的呈现起到了至关重要的作用。因此，各大酱香型白酒企业对于窖面酒的生产都格外重视。

“曲乃酒之骨”，大曲的品质对于窖面酒来说更加重要，因为在窖面糟醅培植的过程中使用了更多的曲粉，目的是生产出窖面风格突出的窖面酒。大量研究表明，关于酱香型白酒高温大曲中能产酱香风味的微生物大多是芽孢杆菌属。由于芽孢杆菌生长代谢的作用，促进了美拉德反应产生大量酱香物质[4-5]。

随着微生物技术的发展，近年来越来越多的酿酒企业重视利用微生物菌剂来提升产质量，取得了一些成果。例如赵希玉等从茅台酒酿造微生物分离得到6株产酱香芽孢杆菌属，将其制成细菌曲后，可生成香草醛、阿魏酸、丁香酸等组成酱香型白酒的香味物质，有助于提高或补充大曲酱香型白酒中的香气物质成分[6]。颜林春等[7]从酱香型高温大曲中筛选到10株芽孢杆菌功能菌，经纯种液体培养后加入制曲原料制成强化高温大曲，强化高温大曲符合酒厂一级大曲质量指标，并且强化大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量明显高于普通大曲。

本研究计划从“国台酒-细菌菌种库”中筛选出功能芽孢杆菌属的菌株，进而利用这些菌株制作菌剂，强化到窖面糟醅的培植过程中，研究其代谢产香能力，评判窖面酒质量是否提高，初步探索决定窖面酒质量的物质成因，最终确定功能菌株和强化工艺，用以提高窖面酒的质量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

菌种：“国台酒-细菌菌种库”中保藏的芽孢杆菌属的菌株，包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌在内的5个种，共计18株菌。

材料：小麦，酒厂提供。

试剂：氯化钠，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；乙醚，分析纯，天津威晨化学试剂科贸有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；2-乙基丁酸，色谱纯，天津市光复精细化工研究所。

仪器设备：生化培养箱，德国Binder公司；Thermo GC-MS Trace 1300气相色谱质谱联用仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；色谱柱（HPFFAP，30 m×0.53 mm，1 μm），美国安捷伦公司；电热鼓风干燥箱，天津市天宇实验仪器有限公司；电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；立式灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；磁力搅拌器，天津布斯特科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 功能微生物筛选和菌剂制作

（1）LB培养基的配制：蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，NaCl 10 g，水1000 mL，调pH7.5，121 ℃高压灭菌20 min。

（2）一级种子培养：从筛选得到的芽孢杆菌斜面挑取少许菌体，转接至250 mL三角瓶，每个瓶中装有50 mL的LB液体培养基。摇床37℃，200 r/min条件下培养至生长稳定期。

（3）二级种子培养：将筛选得到的芽孢杆菌培养液50 mL一分为二，分别转接至1000 mL大三角瓶，内装有250 mL LB液体培养基，即接种量为10%，37℃，180 r/min条件下培养至生长稳定期。

（4）固体菌剂培养：称取22.5 kg小麦润粮（8%加水量，热水）3 h，然后进行磨碎和装盆。每个不锈钢盆中装入的磨碎小麦量为2.6 kg，加入800 mL水（补水量即31%）。分别将筛选出的芽孢杆菌的二级种子培养液转接到对应的不锈钢盆中，不锈钢盆上覆盖纱布和塑料袋，进行固体培养。步骤为：第1天在培养箱中37℃培养24 h；第2天将培养温度调整至45℃，持续2 d；发酵第4天进行翻拌，持续3 d；第7天将培养温度调整至52℃；第8天将培养温度调整至57℃；第9天将培养温度调整至62℃。发酵过程中观察发酵情况，第10天或11天时大致完成菌剂培养。

（5）感官评价和菌株筛选：在结束菌剂培养之后，将菌剂磨成粉，然后利用五分制打分法进行感官初评和复评，从以下感官特征进行评价，共分为6类：酱香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。筛选出酱香强度大，且整体风格明显的样品，挑选其为出发菌株，作为生产应用菌株。同时，检测筛选出的菌株的酸度、糖化力、中性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力指标。

（6）菌剂生产应用：将筛选出的功能芽孢杆菌制作的菌剂等比例混合后应用于2017年贵州国台酒业三轮次窖面酒的生产中，选取了一车间2班6号窖池和二车间10班6号窖池为试验窖池，其他窖池均为对照窖池。应用功能芽孢杆菌制作的固态菌剂（等比例混合）（共10 kg）培植窖面糟醅，菌剂与普通曲粉的混合比例为1∶5，跟踪发酵生产进程，评定窖面酒质量的差异。

1.2.2 测定及数据分析方法

（1）理化指标检测方法

糟醅酸度、还原糖和淀粉含量：酸度测定采用酸碱滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具体检测方法参见沈怡方编著的《白酒生产技术全书》[8]。

酒精度、总酯、总酸：参照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[9]。

蛋白酶活力检测：Folin法[10-11]。（2）挥发性物质检测方法

Ⅱ菌剂挥发性物质组成检测采用顶空固相微萃取结合气质联用仪（SPMEGC-MS）的方法，具体检测条件为：

A.样品前处理方法

称取5 g粉碎后的大曲样品，置于20 mL顶空瓶内，加入5 mL饱和NaCl溶液、50 μL内标溶液（2-乙基丁酸），放入磁力搅拌转子，轻轻摇匀。置于50℃水浴中平衡10 min，插入50/30 μm萃取头搅拌吸附30 min，最后于进样口处解吸5 min。

B.仪器检测条件

GC条件：进样口温度250℃，载气He，柱流速1.5mL/min，吹扫流量：1.0mL/min，总流量25mL/min，分流比10∶1；色谱柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升温程序：40℃保持2 min，以3.5℃/min升温至90℃，以5℃/min升温至230℃保持10 min。溶剂延迟0.1 min。

MS条件：电子电离源(EI)，电子轰击能量70 eV，离子源温度250℃，传输线温度250℃；全扫描模式。

Ⅱ基酒挥发性物质组成检测

A.样品前处理方法

取5 mL白酒样品，15 mL超纯水，50 μL GCMS内标溶液（2-乙基丁酸），混匀，然后加入2.0 mg的NaCl，2 mL的乙醚，涡旋振荡至NaCl完全溶解；静止20 min后，取上层作为供试品。

B.仪器检测条件

GC条件：进样口温度250℃，载气He，柱流速1.5mL/min，吹扫流量：1.0mL/min，总流量25mL/min，分流比10∶1；色谱柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升温程序：40 ℃保持2 min，以3.5 ℃/min升温至90℃，以5℃/min升温至230℃保持10 min。溶剂延迟0.1 min。

MS条件：电子电离源(EI)，电子轰击能量70 eV，离子源温度250℃，传输线温度250℃；全扫描模式。

（3）数据分析方法

GC-MS数据通过AMDIS软件导出，各个窖面酒样GC-MS总离子流图中出峰物质的相对峰强度为出峰物质的峰面积比上内标物2-乙基丁酸的出峰面积。不同酒样之间的差异性分析采用SIMCA 11.5软件进行PLS-DA模型分析，寻找解释窖面酒质量差异成因的物质组分（VIP得分大于1.2）。

2 结果与分析

2.1 功能微生物筛选结果

对18株待测芽孢杆菌菌株进行固态发酵培养之后，将得到的菌剂磨成粉，然后由3名具有多年生产经验的人员进行感官初评和复评，通过打分法，从以下感官特征对菌剂进行评价，共分为6类：酱香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。筛选出酱香强度大，且整体风格明显的样品，挑选其为出发菌株，作为生产应用功能菌株。18株出发菌株对应的菌剂感官得分结果见图1。

图1 功能菌株筛选——感官数据雷达图

由图1可知，在18株菌株中，A29、A27、B12和M2这4株菌株其发酵产物在酱香和整体风格两项感官特征打分最高，香气特征最明显。考虑到目前尚没有评价窖面酒的质量高低的理化或物质成分指标，所以，本研究采用感官评价的方法筛选出可能提高窖面酒质量的功能菌株，继而再进行生产验证。

A29、A27、B12和M2这4株菌株表现出了更为突出的感官特征，进而我们考察了这4株功能菌株的理化指标性能，结果见表1。

由表1可知，筛选出的4株功能菌株，其理化特征数据并不突出，糖化力很低，蛋白酶的活性也不高。有些研究报道称“产酱香功能菌”，一般代谢产蛋白酶的活力也较高[4，5，12]，而本研究中的功能菌株表现为蛋白酶活力不高，但酱香特征非常明显。因此，我们认为不是所有的“产酱香功能菌”都具有较高蛋白酶活性。另外，也可能是本研究模拟大曲高温发酵的固态发酵方式，蛋白酶在高温阶段活力降低的原因。

由于筛选出的这4株功能菌株，酱香特征和整体风格特征明显，本研究考察了4株功能菌株对应的菌剂的挥发性物质成分情况。结果表明，挥发性物质中含量较多的物质分别为四甲基吡嗪、丁酸、2,6-双（1,1-二甲基乙基）-4-羟基-4-甲基-2,5-环己二烯-1-酮、苯甲醛、乙偶姻和3-甲基丁酸。A27、M2、B12这3株菌株代谢产四甲基吡嗪的能力非常强，均占到各自发酵菌剂中所有代谢产物的45%以上。其中，M2代谢产四甲基吡嗪能力最强，达到了所有代谢产物的84%。此结果初步说明，四甲基吡嗪是决定菌剂的酱香特征和整体风格的重要物质之一，与以往的文献报道一致[13-15]。功能菌株挥发性物质代谢结果见图2。

表1 功能菌株理化指标结果

图2 功能菌株挥发性物质代谢结果

表2 试验窖窖面培植的生产工艺原始记录

2.2 功能微生物菌剂的生产应用

将筛选出的4株功能芽孢杆菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌剂等比例混合后应用于2017年酒业窖面酒的二轮次生产中，选取一车间2班6号窖池和二车间10班6号窖池为试验窖池；再选取一车间2班6个其他窖池作为对照窖池；二车间10班6个其他窖池作为对照窖池。应用该4株产酱香微生物制作的固态菌剂（等比例混合）（共10 kg）培植窖面，等量替代原生产曲粉，即实验窖池采用10 kg微生物菌剂和50 kg普通曲粉，混入窖面糟醅中，跟踪发酵生产进程。对照窖培植窖面时完全采用普通曲粉（60 kg）。二轮次试验窖窖面培植的现场生产及其生产工艺原始记录见表2。

在实验过程中，我们跟踪了实验窖池和对照窖池在生产发酵过程中糟醅的理化指标的变化，即跟踪了入窖糟醅和出窖糟醅的酸度、糖分、水分和淀粉含量的变化。结果表明，添加了微生物菌剂的实验窖糟醅理化指标与对照窖糟醅的理化指标非常接近，由于数据较多，本文未展示。检测结果说明通过人工强化微生物菌剂的方式，虽然改变了发酵前初始微生物种群的组成，但是在发酵结束后，并不会影响发酵指标的变化，我们推测，强化的微生物菌剂是改变了酱香风味物质或前体物质含量，进一步影响了窖面酒的感官质量。

在发酵结束后，本研究重点关注了实验窖池和对照窖池生产的窖面酒质量的差异，首先对比了总酸、总酯及酸酯比的情况，结果见表3。

由表3能够看出，添加了微生物菌剂的实验窖窖面酒与利用普通曲粉生产的对照窖窖面酒样，在总酸、总酯和酸酯比这些指标上非常接近。进一步说明了微生物菌剂在发酵过程中的作用是改变了窖面酒中的微量代谢物质的含量，而不是总酸和总酯这些骨架类物质的含量。

表3 窖面酒理化指标结果

本研究对实验窖窖面酒和对照窖窖面酒，共计14个酒样的质量进行感官评定，利用打分法进行感官初评和复评，感官评价的结果见表4。

由表4能够看出，实验窖窖面酒（JM-3-2-6和JM-3-10-6）的感官得分要明显高于对照窖窖面酒的感官得分，主要体现在曲香特征和整体风格特征上的得分高。说明添加了微生物菌剂能够有效提高这两种感官特征。以上结果表明，在酱香型白酒窖面酒的生产过程中，应用4株强化功能芽孢杆菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌剂，能够有效提高窖面酒的质量。

本研究更关心的是哪些微量物质决定了窖面酒质量的差异，现有文献报道均未见这方面的研究成果。因此，我们对生产出来的实验窖窖面酒和对照窖窖面酒进行了挥发性微量物质成分的检测。不同酒样之间的差异性分析采用SIM-CA 11.5软件进行PLS-DA模型分析，寻找解释窖面酒质量差异成因的物质组分（VIP得分大于1.2），见图3。

由图3能够清楚的看出，利用PLS-DA模型分析，能够将质量不同的窖面酒进行分类。图3中黑色（以class 1表示）的样品代表感官得分较高的酒样，得分都在67分以上；而图3中红色（以class 2表示）的样品代表感官得分较低的酒样，基本都低于67分。VIP得分大于1.2的物质有：2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、异戊醇、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。以上这15种物质可能是决定窖面酒质量差异的关键因子，但目前的数据样本还比较少，需要未来在大量数据分析的基础上，结合多元统计的方法，进一步确定哪些物质组分是关键因子，从而指导生产或勾兑。

表4 窖面酒感官评分结果

图3 不同质量窖面酒偏最小二乘法判别分析

在以上基础上，我们确定了利用微生物菌剂提高酱香白酒窖面酒质量的工艺流程，见图4。

图4 强化窖面菌剂工艺流程图

3 结论

本研究根据发酵产物感官情况筛选出了4株功能芽孢杆菌菌株，并将这4株菌株制作成了微生物菌剂，在窖面酒生产过程中实际应用。结果表明添加了微生物菌剂的实验窖窖面酒与利用普通曲粉生产的对照窖窖面酒样，在总酸、总酯和酸酯比指标上非常接近。品酒结果显示，实验窖窖面酒的感官得分要明显高于对照窖窖面酒的感官得分，主要体现在曲香特征和整体风格特征上。通过对窖面酒样的挥发性物质成分分析，以及数据统计分析，初步确定了决定窖面酒质量差异成因的物质组分为2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、异戊醇、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。最终，本研究确定了利用微生物菌剂提高酱香白酒窖面酒质量的工艺流程。