黄芩素对喉癌细胞周期、凋亡率及细胞核DNA的影响

孙吉凤　刘剑凯

【摘要】 目的：探索黄芩素（baicalein，BAI）对喉癌细胞周期、凋亡率及细胞核DNA的影响。方法：体外培养的Hep-2细胞，加入不同浓度的BAI，药物作用后，用MTT法检测细胞增殖情况；用流式细胞术检测对细胞周期及细胞凋亡率的影响；用DNA琼脂糖凝胶电泳法检测对凋亡细胞核DNA的影响。结果：MTT法检测到BAI（10、20、40、80 μmol/L）可明显抑制Hep-2细胞的增殖，呈时间-剂量依赖性（P<0.05）；FCM法检测到BAI（40 μmol/L）可诱使细胞阻滞在S期，凋亡率升高（P<0.05）；BAI（40、80 μmol/L）可诱使细胞核DNA形成“梯状”条带；呈时间-剂量依赖性（P<0.05）。结论：一定浓度的BAI，可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖，诱导细胞阻滞在S期，细胞凋亡率升高，晚期凋亡细胞核DNA断裂形成DNA Ladder。

【关键词】 黄芩素； 喉癌； 细胞周期； 凋亡率

Effect of Baicalein on Cell Cycle，Apoptosis Rate，DNA of Apoptotic Cells in Laryngeal Cancer Cells/SUN Jifeng，LIU Jiankai.//Medical Innovation of China，2018，15（16）：0-016

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Baicalein（BAI） on cell cycle，apoptosis rate，DNA of apoptotic cells in laryngealcancer cells.Method：Hep-2 cells were exposed to BAI at various concentrations respectively，in vitro.MTT assay was used to determine cell proliferation；flow cytometry were used to analyze cell cycle and apoptosis rate；the effect on the DNA was detected by agarose gel electrophoresis.Result：MTT assay showed that the proliferation of Hep-2 cells were significantly inhibited by BAI（10，20，40 and 80 μmol/L），in a time and dose dependent manner（P<0.05）.Hep-2 cells are arrested at the S phase and the apoptosis rate was significantly increased by BAI（40 μmol/L）through flow cytometry（P<0.05）.DNA ladder in Hep-2 cells was induced by BAI（40，80 μmol/L）.Conclusion：BAI can inhibite proliferation of Hep-2 cells，increase the apoptosis rate，induce Hep-2 cells in S phase and late apoptotic cells DNA broken into DNA Ladder.

【Key words】 Baicalein； Laryngeal cancer； Cell cycle； Apoptosis rate

First-authors address：Changchun Medicial College，Changchun 130031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.16.004

喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，其发病率目前有明显增高趋势[1-7]。隨着分子生物学、细胞生物学、肿瘤学等相关生命学科的迅猛发展，正在逐步揭示恶性肿瘤的本质，同时抗肿瘤药物研究也进入了一个新阶段。寻找有效的防癌、抗癌药物一直是肿瘤防治研究的一个重要方面。

黄芩素（baicalein，BAI）是我国传统中药黄芩的主要的有效成分，属于黄酮类化合物，具有抑菌、免疫调节、清除自由基和降血脂等多种药理作用[8-10]。近年来发现黄芩素可能是一种潜在的新型的植物抗肿瘤药物。已有研究表明，黄芩素在体外对于肿瘤细胞系具有抑制作用，而对正常组织细胞几无毒性[11-14]。本实验中，不同浓度黄芩素对人喉癌Hep-2细胞周期时相、凋亡率、凋亡细胞DNA影响展开研究，从而为进一步阐明黄芩素的抗喉癌机制及临床应用提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品 BAI购自美国SIGMA公司，用DMSO溶解后置于-20 ℃冰箱保存，实验时稀释至所需浓度。四甲基偶氮唑盐（MTT）、碘化丙啶（PI）、二甲基亚砜（DMSO）购于北京鼎国生物技术公司。人喉癌Hep-2细胞购自上海细胞生物研究所。RPMI1640培养基购于Gibco/BRL公司。DNA Ladder抽提试剂盒购于碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养 喉癌细胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液，在37 ℃、5% CO2孵箱中培养传代，24～48 h传代一次，传代浓度为5×105个/mL。

1.3 MTT法检测细胞增殖抑制率 收集对数期生长的Hep-2细胞，调整为细胞浓度5×104个/mL接种于96孔培养板中，每孔加200 μL细胞悬液，培养24 h后，同步化培养24 h，再加入终浓度分别为10、20、40、80 μmol/L的BAI继续培养。设置阴性对照组，只加入溶剂DMSO；设置空白对照组，只加入培养液。每组设5个复孔。在37 ℃、5% CO2孵箱中，分别培养24、48 h后，每孔加入

20 μL MTT，孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，轻轻振荡10 min，待蓝紫色结晶物完全溶解后，利用酶标仪，在570 nm波長处检测各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率[15]。

1.4 流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡 收集对数期生长的Hep-2细胞以1×106个/mL细胞数接种于培养瓶中，按照上述细胞培养方法进行培养，并加入终浓度为40 μmol/L BAI，设5个平行样，同时设置阴性对照组。分别培养24、48 h后，收集细胞，用PBS洗涤2次后，以冷的70%乙醇固定，4 ℃条件下固定过夜，用PI溶液避光染色30 min，利用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，通过Modifit LT软件进行分析处理。

1.5 DNA Ladder检测 取对数生长期的Hep-2细胞，上述细胞培养方法进行培养，并分别加入终浓度为40、80 μmol/L BAI，设5个平行样，同时设置阴性对照组。分别培养24、48 h后，收集细胞于Eppendorf管中，用PBS洗涤3次后，采用DNA- Ladder抽提试剂盒提取DNA，取5 μL DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳（75 V，60 min），EB染色后，凝胶成像系统照相。

1.6 统计学处理 用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析，实验数据用（x±s）表示，采用方差分析进行重复测量的计量资料分析，其他资料用单因素方差分析或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BAI对Hep-2细胞增殖的抑制率 BAI（10、20、40、80 μmol/L）作用24 h后，各浓度的抑制率分别从（8.23±0.05）%增加到（86.54±0.04）%，差异均有统计学意义（P<0.05）；作用48 h后，各浓度的抑制率分别为（14.52±0.11）%增加到（96.43±0.02）%，差异均有统计学意义（P<0.05）；见表1和图1。BAI对喉癌Hep-2细胞增殖具有抑制作用，且抑制率呈剂量-时间依赖性（P<0.05）。其中40 μmol/L BAI作用24、48 h，对Hep-2细胞的增殖抑制率达到（53.85±0.07）%和（69.85±0.03）%，为后期研究提供参考浓度和作用时间。

2.2 BAI对Hep-2细胞周期分布及细胞凋亡的影响 流式细胞术结果表明，终浓度为40 μmol/L BAI作用于Hep-2细胞24 h后，S期细胞比例较阴性对照组明显增多，说明BAI诱导Hep-2细胞阻滞在S期；48 h作用后，也表现出相同的影响趋势，差异均有统计学意义（P<0.05）。此外，终浓度为40 μmol/L BAI作用24 h后细胞凋亡率较阴性对照组显著升高；48 h作用后，也表现出相同的影响趋势，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2和表2。

2.3 BAI对Hep-2细胞凋亡后DNA的影响 阴性对照组仅存在一条50 kb以上的大片段基因组DNA，40、80 μmol/L BAI作用后，可见典型的小片段的DNA梯带，即DNA Ladder。80 μmol/L作用后的DNA Ladder条带比40 μmol/L作用后条带亮度更高（P<0.05）。但是24 h作用后与48 h作用后比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明BAI可以诱导Hep-2细胞核DNA断裂，形成DNA Ladder，呈剂量依赖性。见图3。

3 讨论

研究结果表明，BAI（10～80 μmol/L）作用于Hep-2细胞后，对细胞增殖的抑制率最高可达（96.43±0.02）%，呈时间-剂量依赖性（P<0.05），这结果与前期所完成研究成果趋势相同[15]。说明BAI可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖。其中，40 μmol/L BAI作用24 h后，对Hep-2细胞的抑制为（53.85±0.07）%，这为后续研究提供了有效浓度参考。

本研究进一步通过流式细胞术检测BAI对喉癌Hep-2细胞的诱导凋亡作用及对细胞周期分布的影响。结果表明，终浓度为40 μmol/L BAI，一方面可诱使大量的喉癌Hep-2细胞阻滞在S期。另一方面，可以诱导喉癌细胞凋亡率显著升高。研究表明，在细胞凋亡晚期，细胞内依赖Ca2+的核酸内切酶被激活，高分子量DNA减少，核内基因组DNA被水解断裂，断裂发生在核小体之间，产生长度为180～200 bp及其整倍数的DNA片段（DNA Ladder），这种现象是细胞凋亡的重要标志之一，而坏死细胞不具有此特征。虽然并非所有细胞凋亡均出现该特征，但出现该特征的一定是凋亡细胞。利用这一特征，可以证明存在大量细胞凋亡[16-21]。结合本研究中，BAI作用后可见典型的DNA Ladder，以及上述流式细胞术的结果，说明了BAI可诱导喉癌细胞凋亡，呈时间-剂量依赖性（P<0.01）。

综上所述，BAI可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖；使细胞周期阻滞在S期，诱发Hep-2细胞凋亡率升高；BAI诱使得凋亡晚期细胞的核DNA被剪切为DNA Ladder，进而启动后续的细胞凋亡信号，诱使人喉癌Hep-2细胞凋亡，达到抗癌作用。这些研究成果是对BAI抗癌特性的突破性认识，拓展了对BAI抗癌机制的研究，并对进一步研究BAI诱导喉癌细胞凋亡的分子机制指明了方向，如与细胞凋亡相关因子的研究。

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（收稿日期：2018-02-07） （本文编辑：张帅）