猪皮胶原肽的抗氧化活性研究△

李婷，于海涛，金玉翠，刘晓美，李圆圆，王常瞵，吴明泽，代龙，高鹏

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

氧化是所有生物体中必不可少的反应，氧化代谢过程中自由基的形成也是不可避免的。几种慢性疾病如糖尿病、心血管疾病、神经变性疾病和癌症的发生或进展可能与自由基的过量生成有关[1-2]。目前，许多蛋白质水解物及其分离的肽，如大豆蛋白[3]、牛蛙皮[4]、鱼皮明胶[5]、鸡蛋蛋白[6]、水稻胚乳蛋白和油菜籽蛋白[7]等均已被发现具有抗氧化活性。抗氧化肽可以有效清除机体过剩的自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，在预防和治疗自由基诱发的一些慢性疾病和抗衰老方面有广泛的应用前景[8]。

猪皮中胶原蛋白含量达到29%[9]。通过酶解猪皮胶原蛋白得到的酶解产物中具有多种生理活性的肽，其中抗氧化活性多肽由于安全、高效等特点，被用于食品及化妆品中[10]。因此进行猪皮胶原肽抗氧化性的研究具有重要的现实意义。目前，从猪皮中提取猪皮胶原的方法已十分成熟，常用提取方法包括碱提取、酸提取、酶解提取、热水提取[11]。本研究直接以本实验室前期优化的酶解条件[12]进行提取，对其进行超滤分离纯化，得到不同分子量肽段的胶原肽酶解液，浓缩冷冻干燥得到冻干粉，上述各组分与热水提取得到的胶原蛋白进行抗氧化能力比较，为从猪皮中提取抗氧化肽提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

新鲜猪皮(购于济南家家悦超市)，胃蛋白酶(批号：090505，酶活力：3000 U·mg-1，上海蓝季科技发展有限公司)；胰蛋白酶(批号：091105，酶活力：1500 U·mg-1，上海蓝季科技发展有限公司)；牛血清白蛋白(批号：140626-200608，中国食品药品检定研究院)。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批号：G1612053)、抗血酸(Vc，批号：A103537)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；焦性没食子酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、盐酸均为分析纯。

1.2 仪器

卷式超滤膜(1 kDa、3 kDa，北京市旭邦膜设备有限责任公司)；FA2204B万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；BT300-2J蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；HH-S4数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)；UV-1800紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]；电渗析器(沧州市众邦水处理技术有限公司)；高速离心机(上海精密仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 不同分子量猪皮胶原肽的制备

取鲜猪皮，刮去脂肪层及血、肉等杂质，以剪刀剪成直径小于2 mm、长度小于2 cm的碎块，先用8倍量2%碳酸钠溶液脱脂4 h，滤去碱液，水洗至中性，加8倍量水加热煮沸15 min，匀浆3 min，待冷至约40 ℃，以25%盐酸调pH至1.5～2.0，加入1.5%胃蛋白酶(3000 U·g-1)，40 ℃保温酶解2 h，以25%氢氧化钠溶液调pH至7.5～8.0，加入2%胰蛋白酶(1000～1500 U·g-1)，40 ℃保温酶解4 h，酶解液加热煮沸15 min，冰箱冷藏过夜，离心，取上清液，控制操作电压为 30 V，上样流速为50 L·h-1进行电渗析脱盐处理。取部分脱盐后的酶解液减压浓缩(60～65 ℃，-0.07～-0.08 MPa)至相对密度为1.10～1.15(60 ℃)，冷冻干燥后即得猪皮酶解原液冻干粉；将剩余脱盐后酶解液先后用不同分子截留量(3、1 kDa)的超滤膜进行分离，分别得到M>3 kDa组分、1 kDa3 kDa、1 kDa

另取鲜猪皮，切成碎块，脱脂后，加10倍量水煎煮提取2 h，过滤，取上清液，按上述条件冷冻干燥，得到猪皮水提液冻干粉。

2.2 各组分肽含量的测定

2.2.1 溶液的配制 碱性铜的制备：取氢氧化钠1 g，碳酸钠5 g，加水40 mL使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5 g，加水50 mL使溶解，另取硫酸铜0.25 g，加水30 mL使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，取甲液40 mL、乙液8 mL，并加水至50 mL。

对照品溶液的制备：取牛血清白蛋白对照品适量，精密称定，加水制成每 1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：分别精密量取2.1项下各组分冻干粉50 mg，置 100 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取牛血清白蛋白对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL试管中，各加水至1.0 mL，分别加入碱性铜试液1.0 mL，摇匀，再分别加入福林酚试液(取储备液稀释16倍)4.0 mL，立即混匀，置55 ℃水浴中反应5 min，取出，置冷水浴中冷却10 min，照紫外-可见分光光度法，以0号管为空白，在650 nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程为Y=2.490 1X+0.038 5，r=0.999 5。

2.2.3 供试品测定 精密量取供试品溶液1.0 mL，照标准曲线的制备项下自“加入碱性铜试液1.0 mL”起操作，依法测定吸光度，从回归方程中计算各组分总肽的含量。猪皮各组分肽含量测定结果见表1。

2.3 不同分子量猪皮胶原肽体外抗氧化能力的测定

蛋白水解产物的分子量大小对其生理活性具有重要的意义，将2.1项下制备的样品分别配制成质量分数1%、0.8%、0.6%、0.4%、0.2%、0.1%的溶液，采用不同氧化机制测定不同分子量猪皮胶原肽的抗氧化能力，包括清除DPPH·活性、清除·OH活性、清除O2-·活性，分析抗氧化活性与分子量大小的关系。

2.3.1 不同分子量猪皮胶原肽组分对DPPH自由基清除能力测定 精确称量4.10 mg DPPH，溶解到100 mL无水乙醇中，配制成浓度为6.5×10-5mol·L-1DPPH乙醇溶液。分别吸取2 mL样液与2 mL DPPH的无水乙醇溶液置于试管中，摇匀，在室温反应30 min后在波长517 nm处测定吸光度(Ai)；分别吸取2 mL样液和无水乙醇于试管中，摇匀，室温反应30 min后在517 nm波长处测定吸光度(Aj)；最后分别吸取2 mL DPPH无水乙醇溶液与无水乙醇于试管中，摇匀，在室温反应30 min后在517 nm波长处测定吸光度(Ac)[13]。按公式(1)计算DPPH自由基清除率，结果如图1、2所示。

(1)

图1 猪皮胶原肽各组分DPPH·自由基清除作用比较

图2 猪皮胶原肽各组分清除DPPH·自由基能力的比较

从图1不同分子量猪皮胶原肽对DPPH·自由基的清除率趋势可以看出，在实验范围内(0.3～6 mg·mL-1)，不同分子量猪皮胶原肽对DPPH·自由基都有一定的清除作用，且随猪皮胶原肽质量浓度的增加，各组分对DPPH·自由基的清除率不断增加，表明不同分子量猪皮胶原肽对DPPH·自由基的清除率具有量效关系；随分子量增加猪皮胶原肽清除DPPH·自由基效果呈下降趋势，通过比较IC50，各组分清除DPPH·自由基能力顺序为：小于1 kDa组分>1 kDa～3 kDa组分>酶解原液组分>水提液组分>大于3 kDa组分，小于1 kDa组分对DPPH·自由基清除率最高，其IC50值为0.836 mg·mL-1，当质量浓度增加到一定量时，清除DPPH·自由基能力接近Vc。起作用的主要是一些小分子量的肽，可能是由于许多功能性小肽多集中在这部分，这与一些文献报道一致[14]，说明超滤处理能够富集猪皮胶原肽中对DPPH·自由基清除活性强的组分。

2.3.2 不同分子量猪皮胶原肽组分对O2-·活性清除能力测定

2.3.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定 取4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)、加4.2 mL蒸馏水于10 mL试管中，混匀后在37 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入0.3 mL在37 ℃预热过的4.5 mmol·L-1的邻苯三酚，空白管用10 mmol·L-1盐酸代替邻苯三酚的盐酸溶液，迅速混匀后倒入比色皿中，322 nm下每隔30 s测定吸光度，连续记录4 min内吸光度的增加，以10 mmol·L-1HCl溶液配制空白管作为对照，记录结果[15]。

2.3.2.2 不同分子量猪皮胶原肽抑制邻苯三酚自氧化速率的测定 按上述步骤加入pH=8.2缓冲液4.7 mL，然后分别加入肽质量浓度为15 mg·mL-1的猪皮胶原肽溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，蒸馏水补至4.2 mL，加入0.3 mL邻苯三酚迅速摇匀，同样以10 mmol·L-1盐酸溶液作为空白管，同上测定。按公式(2)计算加入猪皮胶原肽后邻苯三酚的自氧化速率，按公式(3)计算清除率。

(2)

(3)

式中：A3为30 s时的吸光度；A4为4 min时的吸光度；△A0为邻苯三酚自氧化速率，△A为加入猪皮胶原肽溶液后邻苯三酚的自氧化速率。

不同分子量猪皮胶原肽对O2-·的清除作用见图3、4。在实验范围内(0.1～1.2 mg·mL-1)，不同分子量猪皮胶原肽对O2-·均有一定清除作用，与未酶解的水提胶原肽相比，猪皮胶原蛋白酶解物具有较高的清除O2-·的能力，随着猪皮胶原肽质量浓度的增加，对O2-·的清除率不断增加，通过比较IC50值，各组分清除能力顺序为：小于1 kDa组分>酶解原液组分>1 kDa～3 kDa组分>大于3 kDa组分>水提液组分，结果显示小于1 kDa组分对O2-·的清除力最强，其IC50值为0.42 mg·mL-1。

图3 猪皮胶原肽各组分对O2-·清除作用比较

图4 猪皮胶原肽各组分清除O2-·自由基能力比较

2.3.3 不同分子量猪皮胶原肽组分对·OH的清除能力测定 精密量取150 mmol·L-1pH=7.4磷酸盐缓冲液2.0 mL、7.5 mmo1·L-1邻二氮菲0.2 mL、7.5 mmol·L-1硫酸亚铁溶液0.2 mL、不同猪皮胶原肽组分试样0.4 mL、蒸馏水0.8 mL、体积分数0.1%过氧化氢0.4 mL于试管中，混匀做试样组，将各试管同时于37 ℃恒温放置1 h，在536 nm处测定吸光度。空白组以蒸馏水代替样品，其余步骤同试样组；空白对照组以蒸馏水分别代替试样和双氧水，其余步骤同试样组，按公式(4)计算·OH清除率。

(4)

式中：A试样为试样组的吸光度值，A0为空白组的吸光度值，A空白对照为空白对照组的吸光度值。

猪皮胶原肽不同分子量组分对·OH的清除作用见图5、6。在实验范围内(0.3～6 mg·mL-1)，不同分子量猪皮胶原肽酶解组分对·OH均有一定清除作用，且随浓度的增加清除能力也增加，不同分子量猪皮胶原蛋白肽组分对·OH的清除能力不同，通过比较IC50，各组分清除能力顺序为：小于1 kDa组分>1 kDa～3 kDa组分>酶解原液组分>大于3 kDa组分>水提液组分，结果显示小于1 kDa组分对·OH的清除力最强，其IC50值为2.195 mg·mL-1。

图5 猪皮胶原肽各组分对·OH清除作用比较

图6 猪皮胶原肽各组分清除·OH自由基能力比较

3 讨论

本实验采用仿生酶解技术酶解新鲜猪皮得到酶解原液，酶解原液经超滤得到M<1 kDa、1 kDa3 kDa 3个不同分子量肽段，猪皮经水提取得到猪皮水提液，上述5组分分别冻干，得到冻干粉。对猪皮胶原肽5组分进行抗氧化性研究，包括对DPPH·自由基、O2-·自由基及·OH自由基的清除实验。结果表明，不同分子量的猪皮胶原肽组分均有一定的抗氧化活性，其中M<1 kDa组分的清除活性最强，这一结果印证了Guillen等[16]研究得出的分子量大小也会影响肽抗氧化活性的结论。