陕产铁棒锤不同生长期不同器官中3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱的含量动态积累规律研究△

杨长花，彭修娟，卫昊，卢宪珍

(1.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.陕西核工业二一五医院，陕西 咸阳 712000)

铁棒锤AconitumpendulumBusch来源于毛茛科乌头属植物，药用部位为块根及幼苗[1]。铁棒锤块根能祛风止痛，散瘀止血，消肿拔毒，用于风湿关节痛，腰腿痛，跌打损伤；外用治淋巴结结核(未破)，痈疮肿毒[2]；幼苗具有解毒，消肿止痛的功效，用于跌打损伤，刀伤，痈肿，疮疖[1]。主产陕西南部、西藏、云南西北部、四川西部、青海、甘肃南部及河南西部[3]。铁棒锤含有乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱等二萜类生物碱[4-7]，二萜类生物碱既是有效成分，也是毒性成分，3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱有显著的镇痛抗炎活性[8-9]，笔者已经测定了乌头碱、中乌头碱、次乌头碱的含量，现对3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱的含量进行测定。据《陕西中草药》记载，铁棒锤以其块根入药味苦辛，性热，有大毒，具活血祛瘀，祛风湿，止痛的功效，用于跌打损伤，风湿性关节炎，腰腿痛，劳伤，恶疮，痈肿，无名肿毒，冻疮，毒蛇咬伤等。民间一直以采挖野生资源入药，随着资源采挖量的日益增加和环境恶化，野生资源日趋枯碣，药用部位的综合利用是解决这一问题的有效途径。国内对铁棒锤研究主要集中在块根的化学成分上，而对地上部分(茎、叶、花、果实)的生物碱研究较少[6]。本研究采用HPLC法测定铁棒锤不同生长期不同药用部位中3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱的含量，旨在认识生物碱在植物内积累的动态变化过程，为人工采收、合理使用、资源开发、质量控制、安全用药等提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(品牌：Waters，型号：E2695，2489紫外检测器)；TE124S分析天平(万分之一，Sartorius公司)；CP225D电子分析天平(十万分之一，Sartorius公司)；PHS-3CPH酸度计(上海佑科)；FW-100D高速万能粉碎机(天津鑫博得仪器有限责任公司)。

1.2 实验试药

3-乙酰乌头碱对照品、去氧乌头碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号P09J7F17616、R29S7F22212，HPLC≥98%)，乙腈、碳酸氢铵、盐酸、甲醇、乙醚、三氯甲烷、硫酸、浓氨水，其中乙腈为色谱纯，其余为分析纯。

铁棒锤于2015年6月到9月采自秦岭太白山上板寺地区，洗净，经陕西中医药大学雷国莲教授鉴定为铁棒锤AconitumpendulumBusch，分离根、茎、叶、花、果实等药用部位，干燥，粉碎备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm，20 μm)；流动相：A(乙腈)，B(0.03 mol·L-1碳酸氢铵溶液，浓氨水调PH值到9.5)，洗脱程序见表1梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：230 nm[10]。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱对照品适量，用0.01%盐酸-甲醇溶液配置成浓度分别为664、735 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取铁棒锤粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入乙醚60 mL和氨试液4 mL，密塞，摇匀，静置过夜，过滤，药渣加入乙醚40 mL连续超声1 h，过滤，然后用乙醚洗涤药渣3次，每次10 mL，过滤，合并滤液与洗液，低温蒸干，弃去药渣。残渣加三氯甲烷2 mL使溶解，转入分液漏斗中用三氯甲烷3 mL分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中再用0.05 mol·L-1硫酸提取三次，每次5 mL，用10 mL三氯甲烷洗涤酸液，加氨试液将酸液pH值调至9，然后用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，最后用20 mL水振摇洗涤三氯甲烷液，低温蒸干三氯甲烷液。残渣用适量0.01%盐酸-甲醇溶解转入5 mL容量瓶中，用0.01%盐酸-甲醇定容至刻度线，摇匀[10-12]。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2项下混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 μL，进样，测定峰面积，以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，做标准曲线。得回归方程为3-乙酰乌头碱Y=0.6×106X-1.3×104，r=0.999 8；去氧乌头碱Y=1.2×106X+3.78×105，r=0.997 4，表明3-乙酰乌头碱在0.664～6.64 μg范围内呈良好线性关系，去氧乌头碱在0.735～7.35 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取2.2项下混合对照品溶液，进样4 μL，重复进样5次，记录峰面积，3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱峰面积的RSD分别为1.7%、1.14%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取样铁棒锤块根药粉1份，按2.3供试品溶液制备方法进行处理，分别在2、4、6、8、10 h进样20 μL，测定峰面积，3-乙酰乌头碱，去氧乌头碱峰面积的RSD值分别为2.77%，0.54%，表明3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱样品溶液在10 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取铁棒锤块根药粉5份，按照2.3供试品溶液制备方法进行处理，分别进样20 μL，测定峰面积，3-乙酰乌头碱，去氧乌头碱含量的RSD分别为4.77%、2.37%，表明重现性良好。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的铁棒锤块根药粉5份，分别精密加入混合对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，计算回收率，3-乙酰乌头碱平均回收率为90.04%，RSD为10.49%；去氧乌头碱平均回收率为92.99%，RSD为7.37%。

2.9 样品测定

取不同生长期不同药用部位的铁棒锤粉末，按照2.3项下制备供试品溶液，进样20 μL，测定峰面积，代入线性方程，计算样品含量。不同生长期不同药用部位铁棒锤中3-乙酰乌头碱、去氧乌头碱的含量见表2，色谱图见图1，点线图见图2和图3。

铁棒锤整个生长周期中，2种活性成分在各部位累变化的趋势基本一致，根、茎、叶在苗期(6月)和盛花期(8月)3-乙酰乌头碱出现2个峰值，在苗期(6月)和7月(花前期)去氧乌头碱出现2个峰值，苗期、花前期、花期，活性成分含量高，具有资源开发利用价值。果实中3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱含量均较高，具有资源开发利用潜力。

表2 铁棒锤不同生长期不同器官中3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱的含量

注：A.混合对照品色谱图；B.铁棒锤苗期幼苗色谱图；C.铁棒锤花前期块根色谱图；D.铁棒锤花前期叶色谱图；E.铁棒锤花前期茎色谱图；F.铁棒锤盛花期块根色谱图；G铁棒锤盛花期叶色谱图；H.铁棒锤盛花期茎色谱图；I.铁棒锤果期块根色谱图；J.铁棒锤果期叶色谱图；K.铁棒锤果期茎色谱图；L铁棒锤果期果实色谱图；1.去氧乌头碱；2.3-乙酰乌头碱。图1 铁棒锤不同生长期不同器官色谱图

图2 6～9月铁棒锤各部位中3-乙酰乌头碱的累积变化

图3 6～9月铁棒锤各部位中去氧乌头碱的累积变化

3 讨论

铁棒锤幼苗3-乙酰乌头碱的含量是0.015 1%，去氧乌头碱的含量是0.166 7%，含量均高于不同生长期根中的含量，幼苗中3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱含量均较高，铁棒锤幼苗是藏医使用的药用部位之一，说明是合理的。花前期、花期3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱含量较高，综合比较，铁棒锤采收的最佳时节应该是花期。3-乙酰乌头碱的含量，花前期含量叶>茎>根，盛花期含量叶>茎>根，果期含量叶>果实>根>茎，叶、茎及果实中3-乙酰乌头碱的含量高于不同生长期根中的含量，具有资源的开发利用潜力。在整个生长期铁棒锤叶是3-乙酰乌头碱含量最高的器官，在盛花期达到最大值，3-乙酰乌头碱是次生代谢产物，盛花期植物绿色部分光合作用强，初生和次生代谢旺盛，可能产生并积累了较多的3-乙酰乌头碱，使叶和茎中3-乙酰乌头碱的含量较高。盛花期后进入果期，生长缓慢，同时繁殖器官的营养消耗增大，可能活性成分也进行了转移，导致了叶、茎中3-乙酰乌头碱含量的降低和果期果实及根中3-乙酰乌头碱含量的增加。果期叶中3-乙酰乌头碱的含量仍高于其他器官，说明铁棒锤叶资源具有巨大的开发利用潜力。铁棒锤根、茎、叶中3-乙酰乌头碱的积累趋势不同，更加证实了这个结论铁棒锤茎、叶中的3-乙酰乌头碱大量转移到根及果实中，使根及果实中3-乙酰乌头碱含量增加，叶及茎中3-乙酰乌头碱含量的大幅度下降。去氧乌头碱的含量，花前期含量叶>根>茎，盛花期含量叶>根>茎，果期含量果实>根>叶>茎，叶中去氧乌头碱的含量高，具有资源的开发利用潜力。叶中去氧乌头碱的含量花前期和盛花期高于根，在花前期达到最大值。去氧乌头碱是次生代谢产物，花前期叶片光合能力强，初生和次生代谢旺盛，可能产生并积累了较多的去氧乌头碱，使叶中去氧乌头碱的含量达到最大值。进入盛花期，生长缓慢，可能活性成分也进行了转移，导致了茎、叶中去氧乌头碱含量的降低；铁棒锤根、茎、叶中去氧乌头碱的积累的变化趋势相同，植物在盛花期和果期的繁殖器官进行了组织结构的快速生长和营养物质的大量积累，可能其积累的量远大于积累的去氧乌头碱的量，导致根中去氧乌头碱的含量不是升高而是降低，计算根整个器官中去氧乌头碱的总量发现去氧乌头碱的总量是增加的，更说明去氧乌头碱是转移到了根中。近年来，铁棒锤资源需求量与日俱增，供不应求，铁棒锤叶、茎、果实作为一种富含3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱的器官，具有资源开发利用潜力，本研究探讨了3-乙酰乌头碱及去氧乌头碱在植物体内积累的动态变化过程，为应用提供科学依据。