6种中药材黄曲霉毒素B1快速检测方法研究△

李细芬，毛雯雯，张雅琴，冯红，许宏亮，李彦川，蔡莹瀛，张兰兰

(数字本草检测有限公司，天津 300400)

中药材容易受到黄曲霉毒素的污染已是不争的事实，相应地，中药材黄曲霉毒素检测方法也成为目前的研究热点，已有较多文献报道[1-7]。目前，黄曲霉毒素的检测方法主要为高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法。液相色谱法为常规检测方法，液相色谱-质谱联用法一般为确证方法[8]。两种方法特异性强、灵敏度高、定量准确，但步骤繁琐，耗时费力，成本高昂，不利于中药材黄曲霉毒素的快速检测，尤其是缺乏实验条件的药材集散地、种植粗加工产地难以广泛普及。因此，急需开发一种成本低廉、方便快捷、简单易学的检测方法，以便于对中药材黄曲霉毒素进行随时随地检测。

胶体金法，又称胶体金免疫层析法(Gold immunochromatography assay，GICA)，是一种将胶体金标记技术、免疫技术和固相层析技术等多种方法有机结合在一起的检测技术。胶体金法以其简单快速、结果直观、成本低廉的显著优势，在医学检验、食品安全等领域应用较为广泛。由于中药材成分复杂，基质干扰严重，在中药材检测中应用较少，仅有少量文献报道。林方芬[9]等应用胶体金方法检测中药饮片，结果与ELISA方法一致；李辉[10]考察了中药材对胶体金检测方法的基质影响，提出中药成分中不含黄曲霉毒素结构类似物香豆素类成分的药材对本法检测结果影响较小。以上研究均未对胶体金方法检测酸枣仁、莲子、薏苡仁、槟榔、决明子和远志6种中药材的前处理方法进行详细报道，本研究旨在通过对6种中药材前处理方法进行研究，建立酸枣仁等6种中药材的胶体金快速检测方法，为胶体金方法应用到更多中药材黄曲霉毒素的快速检测提供参考。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪；Agilent G1321A FLD检测器；Aura U.S.A光化学衍生器；Agilent Zorbax C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；湘仪H1850型离心机；Sartorius QUINTIX224-1CN分析天平；超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与材料

黄曲霉毒素对照品，具体信息见表1。分析甲醇(天津康科德化学试剂公司)；色谱甲醇(德国默克公司)，黄曲霉毒素B1胶体金检测卡(本公司自己生产，批号20160831)；黄曲霉素总量免疫亲和柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；酸枣仁、莲子、薏苡仁、槟榔、决明子和远志药材样品，均购自河北省保定市安国药材市场。

2 实验方法

2.1 中药材黄曲霉毒素B1胶体金快速检测方法

中药材品种间基质差异较大，对胶体金中抗原抗体反应以及胶体金显色的影响不一，因此需对药材的前处理方法分别进行研究。

2.1.1酸枣仁、莲子、薏苡仁前处理方法 称取用液相方法检测不含黄曲霉毒素的酸枣仁、莲子和桃仁样品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黄曲霉毒素B1对照品溶液，制成含黄曲霉毒素B10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的样品，加5 mL 70%甲醇(含氯化钠4%)，涡旋3 min，离心，取上清500 μL于蒸发皿中，置水浴上挥干，再加1000 μL PBS复溶，得样品检测液。取样品检测液100 μL滴加到检测卡上，观察检测结果。

2.1.2决明子、槟榔和远志样品前处理方法 称取用液相方法检测不含黄曲霉毒品素的槟榔、决明子和远志样品粉末各若干份，每份1.0 g，添加黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)对照品溶液，制成含AFB10，2.5，5，7.5 μg·kg-1的样品，加5 mL 70%甲醇(含氯化钠4%)，涡旋3 min，离心，取1 mL上清液，加入4 mL水进行稀释，取稀释后溶液5 mL过免疫亲和柱。过柱方法：5 mL上样，5 mL水洗，1 mL甲醇洗脱。取500 μL洗脱液挥干，加1000 μL 2%BSA/PBS复溶，得样品样测液。取样品检测液100 μL滴加到检测卡上，观察检测结果。

2.1.3胶体金快检方法特异性考察 以酸枣仁样品为例，将AFB1标准溶液添加到阴性酸枣仁粉末中，制备成5、10、20 μg·kg-1系列浓度，再依法制备AFB2、AFG1、AFG2系列浓度样品，按“2.1.1法”处理，每浓度取100 μL滴加到检测卡上，观察检测结果。

2.1.4胶体金法检测样品重复性考察 取“2.1.1法”中添加2.5和7.5 μg·kg-1的酸枣仁样品，按“2.1.1法”处理，每个浓度重复检测10次，观察胶体金检测卡的重复性。

2.2 中药材黄曲霉毒素液相色谱检测方法

2.2.1对照品溶液的制备 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2对照品溶液配制：分别将对照品全部转移至适当容积的容量瓶中，用甲醇洗涤2～3次，一并转移至同一容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得。

混合对照品贮备溶液的配制：分别精密吸取黄曲霉毒素4种标准溶液适量至适当容量瓶中，用70%甲醇定容，最后得AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的浓度分别为40、12、40、12 ng·mL-1。

混合对照品溶液的制备：精密量取上述混合对照品贮备溶液，用70%甲醇制成每1 mL分别含AFB1、AFG12.5、5、10、20、40 ng；AFB2、AFG20.75、1.5、3、6、12 ng的溶液，即得。

2.2.2 色谱条件 Agilent Zorbax C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；FLD荧光检测器，激发波长=360 nm，发射波长=440 nm；流动相：甲醇-水(45∶55)，等度洗脱；柱温30 ℃，流速0.8 mL·min-1，进样量50 μL。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。

2.2.3黄曲霉毒素标准曲线绘制 将黄曲霉毒素标准溶液系列浓度，依次进样检测。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.2.4供试品溶液制备 取药材样品粉末(过二号筛)约15 g，精密称定，置于均质器中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000 r·min-1)，离心5分钟(离心速度2500 r·min-1)，过滤，精密取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，量取续滤液20.0 mL，通过免疫亲和柱，流速每分钟3 mL，用水20 mL洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1.5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL量瓶中，并用纯水定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.5 HPLC方法学考察 (1)线性范围：精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液，按2.2.2色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标，对照品浓度(ng·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线并计算线性范围。(2)精密度：取“(1)线性范围”项下，AFB1、AFG1浓度为10 ng·mL-1，AFB2、AFG2浓度为3 ng·mL-1的混合对照品溶液，按照2.2.2项下的色谱条件进行分析，一天内连续进样6次，连续进样两天，分别记录AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面积，计算日内和日间RSD值。(3)重复性：取阳性莲子样品做重复性试验。按2.2.4药材供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，并按2.2.2色谱条件进行分析。(4)回收率：取阴性薏苡仁样品做回收率试验。AFB1、AFG1的添加水平为10 μg·kg-1，AFB2、AFG2的添加水平为3 μg·kg-1。按2.2.4供试品溶液制备方法，精密添加一定量的标准品溶液，平行制备6份供试品溶液，并按2.2.2色谱条件进行分析，计算回收率。(5)检测项与定量限：根据信噪比S/N=3和S/N=10确定目标物的检出限和定量限。

2.3 中药材样品快检结果与液相结果验证

收集酸枣仁、莲子、薏苡仁、槟榔、远志，决明子样品若干份，分别按2.1.1和2.1.2方法用胶体金试纸条检测，获得快检结果；同时按2.2.4方法进行HPLC检测，获得液相结果；将两种方法检测结果进行对比，判断两种方法的符合率。

3 结果与分析

3.1 胶体金快速检测方法考察结果

3.1.1 酸枣仁、莲子、薏苡仁样品胶体金快速检测基质干扰与灵敏度 酸枣仁样品添加AFB1标准品后经胶体金检测卡检测，检测线(T线)0和2.5 μg·kg-1显色，5和7.5 μg·kg-1浓度不显色，结果如图1，即5 μg·kg-1消线。通过实验发现，莲子和薏苡仁基质干扰与酸枣仁相似，可用同一种方法消除，结果同图1。因此，本胶体金检测卡检测酸枣仁、莲子和薏苡仁样品的灵敏度为5 μg·kg-1，大于5 μg·kg-1的样品均不显色，为阳性。

图1 酸枣仁快检方法灵敏度试验结果

3.1.2 决明子、槟榔和远志样品胶体金快速检测基质干扰与灵敏度 决明子、槟榔和远志药材色素较重，未经净化滴加在胶体金检测卡上，背景很深，影响检测线的显色。因而无法检测，如图2。决明子和远志药材情况类似，图略。决明子等3种药材添加系列黄曲霉标准品后，按方法2.1.2操作，将样品提取液通过免疫亲和柱净化，净化后样品检测液色素明显减轻，从而消除了色素干扰，0和2.5 μg·kg-1浓度显色，5和7.5 μg·kg-1浓度不显色，即5 μg·kg-1消线，大于5 μg·kg-1的样品均不显色，为阳性。结果同图1。因此，本胶体金检测卡检测远志、决明子和槟榔样品的灵敏度为5 μg·kg-1。

3.1.3胶体金法检测样品特异性 对添加系列浓度黄曲霉毒素的酸枣仁样品用胶体金检测卡进行检测，结果显示AFB15～20 μg·kg-1均呈显著抑制，T线不显色，结果如图3。对AFB25～20 μg·kg-1均无抑制，T线均显色，结果如图4，AFG1、AFG2反应结果与AFB2相同，均无抑制，图略。说明本胶体金试纸条对AFB1有特异性，只识别黄曲霉毒素B1，而与其他3种黄曲霉毒素无交叉反应。

图2 槟榔样品过柱前后检测结果

图3 胶体金法对B1检测结果图

图4 胶体金法对B2检测结果

3.1.4胶体金法检测样品重复性 用胶体金检测卡检测2.5和7.5 μg·kg-1两个浓度酸枣仁样品，每个浓度重复10次，结果显示2.5 μg·kg-1浓度均显色，为阴性，且显色一致性较好，如图5；7.5 μg·kg-1浓度均不显色，为阳性。结果如图6。

图5 胶体金法检测2.5 μg·kg-1浓度重复性结果

图6 胶体金法检测7.5 μg·kg-1浓度重复性结果

3.2 黄曲霉毒素液相检测方法考察

3.2.1黄曲霉毒素HPLC标准曲线和线性范围 精密吸取不同浓度的混合对照品溶液，进行液相分析。黄曲霉毒素标准品色谱图见图7。相邻色谱峰之间的分离度分别为3.15、2.24、2.08。

以峰面积为纵坐标，对照品浓度(ng·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线并计算线性范围。结果显示对照品浓度与峰面积呈现良好的线性关系，r≥0.999，结果见图8。黄曲霉毒素B1、G1在2.5～40 ng·mL-1，黄曲霉毒素B2、G2在0.75～12 ng·mL-1范围内线性良好。

图7 4种黄曲霉毒素HPLC图

3.2.2 黄曲霉毒素HPLC精密度 同一浓度黄曲霉毒素混合对照品溶液，一天内连续进样6次，连续进样两天，计算日内和日间峰面积的相对标准偏差(RSD)。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2日内精密度RSD分别为1.17%、1.62%、2.69%、2.52%；日间精密度RSD分别为1.66%、1.26%、2.69%、2.62%。

由此可见，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的日内和日间峰面积RSD均小于3%，表明方法精密度良好。

图8 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准曲线

3.2.3黄曲霉毒素HPLC重复性 取阳性莲子样品平行检测6份得出重复性结果。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的计算结果RSD分别为4.85%、6.74%、3.04%、7.30%，均小于8%，说明黄曲霉HPLC法重复性良好。

3.2.4黄曲霉毒素HPLC回收率 对添加了黄曲霉毒素标准品的薏苡仁阴性样品按2.2供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液进行液相色谱法检测。回收率结果见表2，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的回收率在87.9%～98.0%之间，RSD均小于5.0%。

3.3 快检方法与液相方法比对

收集酸枣仁样品20批、莲子15批、薏苡仁19批、槟榔17批，远志20批、决明子20批，共计111批次，同时用胶体金快检方法和液相色谱法进行检测。检测结果见表3。111批次样本中109批次检测结果与液相结果相符，快检方法的判断准确率为98.2%。其中出现2例与液相结果不符合的情况，槟榔B006号、远志Y001号液相结果分别为4.5 μg·kg-1和3.4 μg·kg-1，而胶体金快检方法判断为阳性(为黄曲霉毒素B1超标，可能为样品中的黄曲霉毒素含量较为接近药典标准5 μg·kg-1，从而出现误判。因此，快检方法适合黄曲霉毒素的初筛性检查，如遇可疑结果还需用药典标准方法进行确证。

4 讨论

对本公司检测数据及文献报道[11-12]分析，选择酸枣仁、薏苡仁、莲子、决明子、槟榔和远志6种黄曲霉毒素污染率高的药材进行胶体金快检方法摸索。6种药材基质不同，需采用不同的前处理方法消除基质影响。

酸枣仁、薏苡仁和莲子基质影响相对较少，通过70%甲醇提取、离心，上清液挥干，除掉提取液中有机溶剂甲醇，再用PBS缓冲溶液复溶，复溶后溶液较为澄清，基本为无色，用胶体金检测卡进行检测时，胶体金显色基本不受基质干扰，零浓度显色清晰，随着样品中黄曲霉毒素浓度的增加，显色逐渐变浅，直至不显色。这是由于黄曲霉毒素胶体金法采用的是免疫竞争原理，样品中黄曲霉毒素的浓度与试纸条上检测线的颜色呈反相关。当样品中的黄曲霉毒素浓度达到5 μg·kg-1及以上时，检测线完全被抑制不显色，为阳性结果；低于5 μg·kg-1，检测线显色，为阴性。这种判断符合《中华人民共和国药典》规定的限量标准，因此可用于对酸枣仁、薏苡仁和莲子中的黄曲霉毒素B1进行初筛性检测。

表3 111批次样品两种方法检测结果

注：表中“+”表示超过药典规定标准，“-”表示未超过药典规定标准。

槟榔、远志和决明子用甲醇提取后，色素过重，仅用挥干有机溶剂的方法不能消除色素等基质的影响。因此，需采用一定的净化方法，将提取物中的色素等其他杂质清除或降低。黄曲霉毒素免疫亲和柱净化是目前较好的净化方法，它采用的是特异性抗原抗体结合原理，不能与亲和柱中包埋的黄曲霉毒素抗体结合的杂质流出柱子，只有黄曲霉毒素能结合在柱体上，再用甲醇进行洗脱，从而实现目标物与杂质的分离，有效消除了基质影响。胶体金法样品需要量少，只需取1mL提取液过柱净化，节省了实验时间，实现了槟榔、远志和决明子的快速检测，整个样品检测30 min内可完成。

液相色谱法检测黄曲霉毒素一般有多种流动相系统：甲醇-水[13]，甲醇-乙腈-水[14]，乙腈-水[15]，需根据实验室液相色谱系统进行选择优化。本实验室液相色谱系统选用甲醇-水(45∶55)作流动相，取得了较好效果，4种黄曲霉毒素分离度均在1.5以上，精密性、回收率和重复性良好，检测一个样品约需5 h完成。而快检方法只需要30 min即可完成，大大提高了样品的检测效率。快检方法使用过程中无需使用黄曲霉毒素标准品，只需胶体金检测卡和少量试剂即可完成，安全、环保、省时、省力、省成本，无需专业人员、可用于大量样本的快速筛查和现场及时筛查。

本文对2015版《中华人民共和国药典》中规定的19种药材中的6种进行了快检研究，其它药材的快检有待今后继续研究。