新型纳米脂质体包载白藜芦醇预防糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的实验研究

周开珩

0 引言

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)作为糖尿病的一种严重的心血管并发症，其发病机制尚不明确[1]。研究显示，糖尿病患者体内持续性的高血糖症能够导致心肌细胞产生过量的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，引起脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗及心肌细胞钙离子调节异常，最终导致心肌细胞凋亡，左心室收缩、舒张功能障碍，且没有有效的防治方法[2]。

白藜芦醇(Resveratrol，RSV)作为一类多酚类抗毒素，最早发现存在于葡萄皮及红酒中。国外研究显示，长期给予白藜芦醇能够明显增加糖尿病大鼠心肌抗氧化蛋白的表达，有效减少心肌的凋亡及梗死面积，从而保护糖尿病大鼠心脏[3-4]。同时，有报道，糖尿病大鼠口服白藜芦醇2周后，心肌细胞对葡萄糖的摄取及利用明显增加[5]。另外，Zhang等[6]研究显示，糖尿病大鼠口服白藜芦醇20 mg/(kg·d)4周后，大鼠左心室收缩功能明显提高。因此，白藜芦醇作为一种安全、有效的天然化合物，可通过抗炎、抗感染、抗氧化应激等发挥改善糖尿病心血管病的作用[7-9]。但是作为难溶性化合物，白藜芦醇溶解度低(50 μg/ml)，且稳定性差，高温、强光、pH变化会导致其分解，因此，其在体应用存在剂量低、无法满足正常治疗剂量及潜在安全性等问题[10]。

纳米脂质体作为一种新型的药物递送载体，具有良好的生物相容性、减少包封药物毒性、增加药物稳定性及浓度等性质，已经广泛用于难溶性及不稳定性药物的递送[11]。

目前国内外没有应用纳米脂质体包载白藜芦醇预防糖尿病心肌病的相关实验研究。因此，本次研究采用新型的纳米脂质体包载白藜芦醇，从而增加其溶解度及稳定性，并以链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠为实验动物模型，应用透射电镜观察、TUNEL凋亡染色结合Western blot技术，综合考察包载白藜芦醇纳米脂质体对于糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠60只，体重180～220 g，清洁级，由温州医科大学实验动物中心购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 仪器与试剂 白藜芦醇(Sigma-Aldrich公司)，混合磷脂S75(德国Lipoid GmbH公司)，ATX Tris 缓冲液及油酸(Sigma-Aldrich公司)，戊巴比妥钠(上海西唐生物科技有限公司)，链脲佐菌素STZ (Sigma-Aldrich公司)，TUNEL凋亡试剂盒(Roche Applied Science)，AKT蛋白、PAKT一抗(Cruz Biotechnology)，血糖试纸(德国罗氏活力型血糖仪专用试纸)。

1.3 实验方法

1.3.1 新型白藜芦醇纳米脂质体的制备及其性质考察 参考Caddeo等[10]报道的白藜芦醇脂质体的制备方法。将白藜芦醇2.5 mg，混合磷脂S75 120 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 缓冲液，避光过夜，形成混合溶液，将上述溶液在冰浴条件下应用超声匀浆机进行超声处理，形成载药脂质体(2.5 mg/ml)。超声条件：持续超声5 s，停2 s，连续循环45次，超声探头振幅13 μm，所有操作均在避光条件下进行。按照上述方法制备空白脂质体白藜芦醇溶液：将白藜芦醇2.5 mg、油酸12 mg加入到1 ml ATX Tris 缓冲液避光过夜形成混合溶液，然后将上述溶液在冰浴条件下应用超声匀浆机进行超声处理，形成白藜芦醇溶液(2.5 mg/ml)。超声条件：持续超声5 s，停2 s，连续循环45次，超声探头振幅13 μm。

白藜芦醇脂质体的性状考察：采用透射电子显微镜考察载药脂质体表观形态，应用动态光衍射法测定载药及空白脂质体的粒径和Zeta电位分布。

包封率是评价载体性质的重要指标。包封率测定方法简述如下：将上述制备载药脂质体溶液放入透析袋(截留分子量12～14 kD)，室温透析2 h，除去未包封药物及其他制备辅料。甲醇破坏脂质体，应用HPLC测定载药脂质体中药物含量。

载体包封率=载药脂质体中药物含量/最开始加入药物×100%

1.3.2 实验分组 采用随机数字表法将60只雄性健康SD大鼠(180～220 g)进行随机分组：正常对照组15只(control)、糖尿病组15只(DM)、白藜芦醇溶液组15只(1 ml/kg)、白藜芦醇脂质体组15只(1 ml/kg)。

1.3.3 糖尿病实验动物模型建立及给药方法 实验动物进行随机分组后维持饲养1周，1周后进行Ⅰ型糖尿病动物模型的建立。实验组动物腹腔注射1%链脲佐菌素STZ (70 mg/kg)，对照组动物腹腔注射同剂量生理盐水。于注射后第3、7、14天尾静脉取血测定血糖。3次测定结果均>16.7 mmol/L且实验动物明显出现多饮、多食、多尿以及体重下降等现象即说明造模成功。此后白藜芦醇干预组动物尾静脉给药白藜芦醇脂质体或白藜芦醇溶液(1 ml/kg)，每周2次持续给药12周。糖尿病组、正常对照组动物每周给予同剂量生理盐水。12周后处死大鼠取材，剩余心肌细胞-80 ℃保存。

1.3.4 透射电镜检查 取各组大鼠左心室组织标本(1 mm3)，经新鲜配置的多聚甲醛+戊二醛4 ℃ 前固定1 h，PBS反复洗涤，锇酸后固定2 h；梯度酒精脱水，环氧树脂Epon812包埋，LKB-1型超薄切片机切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，透射电镜JEM-1230(JEOL，Tokyo，Japan)下观察拍照。

1.3.5 心肌细胞TUNEL染色 按照罗氏TUNEL凋亡试剂盒说明书，将组织切片脱蜡、酒精梯度浸洗，Proteinase K工作液透化，在切片上加TUNEL反应液，盖膜，37 ℃孵育60 min，PBS缓冲液冲洗3次，DAB室温显色10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，酒精梯度脱水、透明和封片，于光镜下观察，每只大鼠3张切片，每个切片随机计数无重叠具有代表性的5个400倍视野，以平均每100个细胞核中含凋亡细胞的数量作为心肌细胞凋亡指数(Apoptosis Index，AI)。

1.3.6 Western blot技术检测 将组织从-80 ℃冰箱中取出，在裂解缓冲液中匀浆，4 ℃离心，取上清，高速离心，沉淀用1 ml Triton X-100缓冲液溶解，BCA试剂盒测定蛋白浓度备用。

每组按20 μg蛋白的溶液体积上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压设为90 V，根据Maker移动情况适时终止电泳。进行转膜、封闭、洗膜，加入1∶5 000 稀释的AKT及PAKT一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加二抗室温孵育1 h。以β-actin为参照，DAB显色后应用凝胶成像分析仪分析。

2 结果

2.1 白藜芦醇载药脂质体的质量表征 脂质体透射电镜观察结果显示，空白、载药脂质体均呈现标准的椭球型，且表面光滑无黏连、粒径约100 nm，载药前后无明显变化。动态光衍射法测定载体粒径及Zeta电位结果显示，空白、载药纳米脂质体的平均粒径分别为(95.43±2.1)nm、(101.34±3.2) nm。多分散系数PI值分别为0.103、0.110(均<0.2)。同时，Zeta电位测定结果显示，空白、载药纳米脂质体分别为(-25.3±1.8)、(20.6±1.6) mV。包封率测定结果显示，载药纳米脂质体的包封率为90.76%±2.13%。见图1。

2.2 大鼠心肌透射电镜检查结果 各实验组大鼠心肌组织透射电镜检查结果见图2，与正常对照大鼠比较，未经任何形式干预的糖尿病组大鼠的心肌肌丝、肌原纤维的Z线(Z-line)都出现了严重的溶解、破坏，心肌细胞的线粒体出现明显的空泡化。经过白藜芦醇溶液干预后，糖尿病大鼠心肌细胞仍存在明显损伤，接近糖尿病大鼠，而白藜芦醇脂质体干预后，大鼠的心肌细胞肌丝、Z线完整，线粒体结构饱满，心肌细胞超微结构基本接近正常对照组。

图1 透射电镜观察空白及载药纳米脂质体

2.3 心肌细胞的TUNEL凋亡染色结果 正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色，箭头所示为凋亡心肌细胞的细胞核。与正常对照组大鼠比较，未经任何形式干预的糖尿病组动物及经过白藜芦醇溶液干预的大鼠心肌细胞凋亡指数显著升高(P<0.05)。与糖尿病组及白藜芦醇溶液干预组比较，经过白藜芦醇脂质体干预组大鼠心肌细胞凋亡指数显著下降(P<0.05)，接近正常对照组水平。见图3。

2.4 心肌组织Western blot分析结果 各组实验大鼠心肌PAKT、AKT蛋白Western blot检查结果如图4所示。与正常对照组比较，未经任何药物干预的糖尿病组大鼠及经过白藜芦醇溶液组干预大鼠心肌PAKT/AKT含量显著下降(P<0.01)。与糖尿病组大鼠及白藜芦醇溶液组比较，经过白藜芦醇脂质体治疗干预的大鼠心肌PAKT/AKT含量升高(P<0.05)，接近正常大鼠水平。

图2 透射电镜观察各组大鼠的心肌超微结构(n=15)

图3 各实验组大鼠TUNEL凋亡染色结果(n=15)

图4 Western blot 检测各组大鼠心肌PAKT及AKT的表达(n=15)

注：1.正常对照组，2.糖尿病组，3.白藜芦醇溶液组，4.白藜芦醇脂质体组。与正常对照组、白藜芦醇溶液组比较，*P<0.01

3 讨论

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起的一种严重的并发症，其致病因子复杂，病理特征多样，主要包括心肌细胞肥大、凋亡及纤维化、心功能障碍等[12-13]，最终导致患者死亡，目前没有有效的防治方法。已有研究证实，DCM导致的心肌细胞凋亡可以引起糖尿病患者心脏收缩、舒张单元减少，造成心脏重构，最终导致左心室功能紊乱[14]。因此，降低糖尿病患者的心肌细胞凋亡水平有望提高患者的心功能，实现DCM的防治功能。

白藜芦醇是一类非黄酮类多酚化合物，具有清除自由基、抗氧化[15]，减少高糖诱导的心肌细胞氧化损伤等作用[16-17]。但是由于白藜芦醇存在稳定性差、溶解度低等问题，限制了其在体应用。本次研究在前期研究基础上应用新型纳米脂质体包载白藜芦醇，在体考察其对于糖尿病心肌病引起的心肌细胞凋亡的预防作用及其机制。

透射电镜观察结果证实，本次实验制备的载药纳米脂质体形态圆整，粒径在100 nm左右，无黏连，且载药、空白脂质体的多分散指数均<0.2，说明载体粒径分布均匀；另外，载体的Zeta电位测定结果显示，载药及空白脂质体的Zeta绝对值均>15 mV，说明载药、空白脂质体稳定性好；包封率测定结果也显示，载药脂质体对于白藜芦醇的包封率高达90.76%±2.13%，说明本次研究制备的脂质体能够较好地实现对于难溶性药物白藜芦醇的包载，提高其溶解度及稳定性。

未经任何形式药物干预的糖尿病组及白藜芦醇溶液干预组大鼠12周后心肌细胞超微结构破坏严重，线粒体呈明显的空泡化，心肌肌纤维及Z线断裂、溶解。而经过白藜芦醇脂质体干预后，大鼠心肌细胞超微结构明显好转，空泡化的线粒体数量明显减少，心肌肌纤维及Z线清晰，连贯，心肌细胞超微结构接近正常对照组细胞，说明白藜芦醇脂质体干预能够有效保护心肌细胞的超微结构，减少因为高糖引起的心肌细胞损伤。同时TUNEL凋亡染色结果也证实，与正常对照组比较，未经任何形式药物干预的糖尿病组及白藜芦醇溶液干预组大鼠12周后，心肌细胞凋亡指数升高(P<0.05)，而经过白藜芦醇脂质体干预后，大鼠的心肌细胞凋亡指数显著下降(P<0.01)，说明白藜芦醇脂质体能够有效预防糖尿病心肌病引起的心肌细胞凋亡。

为了研究白藜芦醇对于预防糖尿病心肌病心肌细胞凋亡的作用机制，本研究应用Western blot分析各实验组大鼠心肌细胞AKT、PAKT蛋白含量。AKT作为凋亡相关通路PI3K/AKT的下游蛋白，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AKT影响细胞的多种功能，包括细胞的生长、增殖、新陈代谢等。已有研究证实，作为AKT的一种活化形式，PAKT(磷酸化的AKT)能够显著降低缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[18]。同时，PAKT蛋白的表达下降与心力衰竭、心功能障碍密切相关[19]。本研究证实，与正常对照组比较，未经任何药物干预及经过单纯白藜芦醇溶液干预的糖尿病大鼠心肌细胞PAKT/AKT比值降低(P<0.05)，而经过白藜芦醇脂质体干预后，PAKT/AKT的比值升高(P<0.05)，说明白藜芦醇脂质体能够激活AKT蛋白，通过PI3K/AKT途径调控糖尿病心肌病引起的心肌细胞损伤。

综上所述，应用新型纳米脂质体包载白藜芦醇后，能够激活PI3K/AKT信号通道，实现对于糖尿病心肌病致心肌细胞凋亡的预防作用，为临床糖尿病心肌病患者的防治提供了一种新的思路。而单纯的白藜芦醇溶液没有显著效果，大鼠应用白藜芦醇溶液后，其内环境的影响改变了白藜芦醇溶液组成，使得白藜芦醇在体内重新析出成为难溶性物质，从而无法发挥应有的效果，有待后续试验进行相关研究。