高效液相色谱法分析芦丁在灌胃给药大鼠体内的组织分布

李巧稚，肖丹丹，王晓颖，段青娅，刘雪松，李 倩

0 引言

芦丁(Rutin，又名芸香苷、路丁、络通或槲皮素-3-O-芸香糖苷)是黄酮醇槲皮素与芸香二糖[α-L-鼠李吡喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]形成的糖苷[1-2]，其广泛分布于植物界，在植物的根、茎、叶、花、果实和种子都有存在[3]。芦丁的分子式为C27H30O26·3H2O(结构式见图1)，相对分子质量为610.51。其熔点为177～178 ℃，在室温下略溶于水，能溶于热水和乙醇。芦丁甲醇溶液的最大紫外吸收波长为258～361 nm，其遇光容易变质，所以需要在阴凉处保存[2,4-5]。芦丁具有多种药理活性，主要包括抗自由基活性、抗脂质过氧化氢作用、血管舒张作用、抗病毒作用、拮抗血小板活化因子作用、抗炎镇痛作用、抗急性胰腺炎(AP)及对胃溃疡的保护作用[6-11]。目前对于芦丁的含量检测主要采用高效液相色谱法[12-17]。曲克芦丁为芦丁的修饰药物与临床药物，已用于多种疾病的临床治疗[18]。曲克芦丁脑蛋白水解物注射液是曲克芦丁与动物脑蛋白水解液的复合制剂，具有通过血脑屏障的作用，可以更好地用于治疗脑血管疾病[19-20]。芦丁具有良好的发展前景，笔者对芦丁在大鼠体内的组织分布进行了研究，为临床疾病的治疗提供依据。

图1 芦丁的结构式

1 仪器与材料

1.1 材料 芦丁对照品(国家标准含量：98%，西安天丰生物有限公司，CAS号：153-18-4)；山柰酚对照品(内标物，分析标准品，含量≥ 98%，阿拉丁，CAS号：520-18-3)；甲醇(色谱纯，天津市光复精密化工研究所)；磷酸(分析纯，含量：85%，天津市光复精密化工研究所)；乙酸(分析纯，98%，天津市光复精密化工研究所)。

1.2 仪器 安捷伦高效液相色谱(Agilent 1260 series，Agilent 1260 DAD)；低温离心机(Eppendroff公司)；离心机(Eppendoff公司)；精密天平(BS4202S型，瑞士Mettler公司)；数控水浴恒温箱(宁波天恒仪器厂)；-80 ℃超低温冰箱(Thermo公司)；低温冷冻离心机(Beckman公司)；涡旋混合器(江苏其林贝尔)。

1.3 实验动物 取8周龄健康雄性SD大鼠，体重(200±10) g，SD大鼠均来自于哈尔滨医科大学附属第二医院的实验动物中心，该中心已经通过国际动物委员会(IACUC)批准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇(A)-0.03%磷酸水(B)，梯度洗脱条件参见表1。柱温：30 ℃；流速：0.8 ml/min；检测波长：258 nm；进样量：10 μl。

2.2 对照品的制备

2.2.1 芦丁储备液的制备 精密称取芦丁对照品37.50 mg于25 ml的容量瓶中，用组织提取液超声溶解，配制成1.5 mg/ml的储备液(在4 ℃冰箱中储存备用)。

表1 梯度洗脱条件

2.2.2 内标物储备液的制备 精密称取山奈酚对照品10 mg于10 ml的容量瓶中，用组织提取液超声溶解，配制成1 mg/ml的储备液(在4 ℃冰箱中储存备用)。

2.2.3 对照品溶液的制备 取上述芦丁储备液，用组织提取液稀释成芦丁质量浓度分别为0.75、1.5、3.0、15、75、425、750 μg/ml的系列对照品溶液。

2.2.4 质控(QC)样品的制备 新配制质量浓度为定量下限、低、中、高4种浓度的芦丁对照品溶液，其质量浓度分别为0.75、1.5、15、750 μg/ml，在4 ℃冰箱中储存备用。

2.2.5 组织提取液的制备 精密量取50 ml的乙酸置于500 ml的容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，作为组织提取液，在4 ℃冰箱中储存备用。

2.3 各组织样品的处理 移取大鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑组织各1 g，分别加入定量的生理盐水2 ml (1∶2,w/v)，用匀浆机匀浆成均匀的组织液。精密量取组织的匀浆液200 μl，置于1.5 ml离心管中，再加入组织提取液100 μl，涡旋振荡1 min，然后以12 000 r/min离心10 min，取200 μl上清液，再加入10 μl的内标溶液。用孔径为0.45 μm的有机滤头过滤，取滤液10 μl进样，记录各空白组织色谱图。

2.4 专属性考察 按照“2.3”项下进行操作后，精密量取空白大鼠组织提取液100 μl，进行HPLC检测，色谱图见图2A；在空白大鼠提取液加入一定浓度的芦丁对照品及内标溶液，色谱图见2B；大鼠灌胃给药后，加入内标溶液，色谱图见图2C。

2.5 线性关系考察 移取空白对照组生物基质(肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑组织)各0.15 g，加入定量的生理盐水0.3 ml，用匀浆机匀浆成均匀的组织液。精密量取各组织的匀浆液200 μl，置于1.5 ml离心管中，再加入配制好的芦丁对照品溶液，按照“2.3”项下的方法进行处理，制备成终浓度为0.25、0.5、1、5、25、125、250 μl/ml的对照品溶液，取上述对照品溶液10 μl，注入色谱仪，记录色谱图。芦丁在各组织中的线性范围见表2，线性关系良好。

图2 大鼠在组织样品中芦丁的HPLC色谱图

取对照品溶液，按照“2.3”项下方法进行处理，当样品的检测信号与空白基质的干扰信号比≥10，即信噪比(SIN)≥10时，即为测定浓度的最低定量限(LLOQ)。

2.6 准确度与精密度试验 精密量取空白对照大鼠的肺组织匀浆液200 μl，加入芦丁QC样品100 μl，按照“2.3”项下的方法进行处理，得到质量浓度为0.25、0.5、5、250 μg/ml 4种浓度的QC样品溶液，每个浓度点制备5份平行样，连续测定3 d，按照上述的色谱条件进行分析，以芦丁与内标峰面积的比值，计算回收率和精密度。见表3。

表2 芦丁的线性关系与线性范围(μg/ml)

表3 芦丁的准确度与精密度测定结果(n=5，n=15)

2.7 稳定性试验 按“2.2”项下制备低、中、高3种浓度的QC样品，按照“2.3”项下操作进行处理，每个浓度点制备5份平行样，1周内连续进样，测定大鼠肺脏组织匀浆样品中芦丁的含量，结果显示，其含量均无明显变化，RSD<15%。见表4。

表4 室温条件下1周内芦丁稳定性测定结果(n=5)

2.8 提取回收率试验 按“2.2”项下制备低、中、高3种浓度的芦丁对照品，按照“2.3”项下操作进行处理，每个浓度点制备5份平行样，按照上述色谱条件进行检测，计算芦丁与内标物质的峰面积的平均比值A；另外，配制相同的低、中、高浓度的QC样品各1份，按照上述HPLC条件进行检测，计算各个浓度对照品溶液中芦丁的峰面积与内标物峰面积的平均比值B；按A/B×100%计算各个浓度点的提取回收率，见表5。

表5 芦丁提取回收率测定结果(n=5)

2.9 组织分布研究 取雄性SD大鼠12只，随机分成2组，第1组将芦丁超声溶于5% CMC-NA制成混悬液，按照生药量200 mg/(kg·d)灌胃给药。第2组给予相同体积的生理盐水，每隔10 h灌胃给药1次，给药5次后将SD大鼠全部处死。分离大鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑组织，用生理盐水将血液洗净，滤纸擦干。按照“2.3”项处理组织样品，测定并计算给药后大鼠肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑组织的芦丁含量，结果以每1 ml组织中待测成分的量(μg)表示，见图3。

图3 灌胃给药芦丁在各组织中的浓度(n=6)

3 讨论

3.1 给药方案的选择 芦丁的药物动力学表明其符合二房室模型，芦丁在体内吸收较快。根据对芦丁药物动力学参数的分析[21]，本实验室采用每间隔10 h给药1次，共给药5次，使芦丁达到稳定血药浓度后进行测定。

3.2 实验设备与方法的选择 本实验通过高效液相色谱法测定大鼠在各组织中芦丁的含量，该方法操作简单，灵敏度高，准确可靠，相比于液质联用等技术，该方法使用的仪器价格低廉，应用广泛。整个实验过程中应用甲醇与酸水作为流动相，不仅对环境破坏小，而且价格较低，方便易得。

3.3 结果分析 芦丁在大鼠体内分布广泛，且在肌肉和肾脏分布较多，其次是肝脏和肺脏，在脑中未检出，这可能是由于血脑屏障的原因。在临床治疗过程中，为了达到曲克芦丁脑部治疗的作用，可将其制成曲克芦丁脑蛋白水解液，这与本文的检测结果一致。