药物溶出/吸收仿生系统法研究异欧前胡素溶出特征及与体内药代动力学相关性分析

徐雪芳，李超，王洋洋，黄聪，何新，4

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.天津中医药大学中药学院；3.天津凯莱英生命科学技术有限公司；4.天津市现代中药重点实验室，天津 300193)

白芷为伞形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.]的干燥根，始载于《神农本草经》，有2000多年的药用历史，为中医临床常用中药之一[1]。异欧前胡素作为白芷的主要活性成分，其药代动力学研究多通过高效液相色谱(HPLC)分析[2-4]，由于血浆样品多存在含量低，成分复杂等问题，建立更为灵敏、特异、及快速的分析方法尤其重要，本研究拟建立该药物的UPLC-MS/MS分析法[5]，并将该方法应用于异欧前胡素的药代动力学研究。

药物溶出/吸收仿生系统(drug dissolution/absorption simulating system，DDASS)是近几年发明出来的一种连续性的动态仿生系统[6]，可用来预测药物在体内的溶出和吸收程度。He等成功应用该系统预测水溶性药物、酯化前体药物及pH依赖性可溶药物的口服吸收[7-10]。Li等基于对DDASS的改进，将研究对象扩大到片剂、软胶囊和硬胶囊等多种剂型，用于口服固体制剂体内溶出和吸收特征的同步预测[11-13]。本研究也同时将通过DDASS对异欧前胡素的溶出行为进行评价，以期为其药代动力学行为提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC-MS/MS联用仪(美国WATERS公司)，色谱工作站： Waters EmpowerTM-MassLynxTM；Allegra 64R 高速离心机(美国BECKMAN公司)；WH-3 微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；AX205十万分之一天平(瑞士Mellter Toledo公司)；Millipore Milli-Q∕30 L超纯水机(法国Millipore公司)；海尔-86 ℃超低温保存箱(中国海尔)；OA-SYSTMHeating System(USA)；N-EVAPTM111 Nitrogen Evaporator(USA)。异欧前胡素(图1A)纯度98.0%购置于天津马克生物技术有限公司(天津，中国)。佛手柑内酯(图1B)作为内标物，购置于南京泽朗医药有限公司(南京，江苏，中国)。色谱纯乙腈购置于迪马科技有限公司(美国)。其它分析纯化学试剂均购置于康科德科技有限公司(天津，中国)，溶剂经过0.22 μm微孔滤膜滤过并脱气。超纯水通过Milli-Q系统制备(Millipore，Billerica，MA)。

1.2 动物

雄性Wistar大鼠10只、平均重量(220±20) g，购于天津实验动物中心。实验前12 h禁食，自由饮水。

1.3 储备溶液的制备

精密称定异欧前胡素、内标-佛手柑内酯标准品，溶剂为甲醇，配制成1.0 mg/mL的储备液。用甲醇稀释、制备系列异欧前胡素标准溶液(含1 μg/mL的内标物)，浓度分别为20，40，100，200，500，1 000，2 500和5 000 ng/mL。置4 ℃冰箱保存。

血浆样品中加入适当量的标准溶液制备浓度为4，8，20，40，100，200，500和 1 000 ng/mL的异欧前胡素的系列标准品。以相同的方式制备浓度为4，20，200和800 ng/mL异欧前胡素的质量控制样品，分析前存储于-20 ℃。标准品和质量控制样品均在每日分析前制备。

1.4 血浆样品的处理

血浆样品(100 μL)中加入20 μL内标物(1 000 ng/mL)。血浆经8倍乙酸乙酯萃取，混合物经涡旋震荡、在4 ℃下、14 000 rpm离心10 min。抽取上层有机层750 μL溶液转移至其他试管中，在室温、真空下蒸发至干燥。用100 μL甲醇溶液复溶，涡旋混合1 min，离心，5 μL上清液进样。

2 方 法

2.1 色谱条件

异欧前胡素的溶解性和稳定性研究采用HPLC-UV方法：安捷伦ODS C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm × 5 μm)；流动相是乙腈-水(75/25)，流速1.0 mL/min，30 ℃；紫外波长305 nm下监测流出物，进样体积10 μL，线性范围是0.002～0.500 mg/mL。

血浆样本分析色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm × 100 mm × 1.7 μm)色谱柱，柱温30 ℃。自动进样器温度4 ℃，进样体积5.0 μL。流动相A：乙腈，B：水(0.05%甲酸)，梯度洗脱程序如下：0～1 min，70%～90% A相；1～4.8 min，90% A相；4.8～5.0 min，A溶剂线性变化由90%～70% A相，5.0～5.5 min，70% A相。

质谱分析采用ESI正离子并设定MRM模式。源温：80 ℃，脱溶剂温度：110 ℃，毛细管电压3.5 kV，锥孔电压50 V，脱溶剂气流速650 L/h。锥孔气和脱溶剂气为氮气。IO：m/z 271.02→202.9，IS：m/z 216.9→173.7。IO和IS最佳碰撞能量分别是15和30 eV。

2.2 方法学考察

根据FDA生物方法验证指南[14]对异欧前胡素进行方法学考察，考察内容包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、回收率和基质效应。

2.2.1 专属性 通过比较10只大鼠空白血浆与分别含有异欧前胡素(4.0 ng/mL)和内标物(200 ng/mL)血浆的色谱图来评价该方法的专属性。

2.2.2 线性和灵敏度 每日样品分析前制备标准曲线。使用标准浓度为4.0，8.0，20，40，100，200，500和1 000 ng/mL制备该曲线。标准曲线以异欧前胡素与内标物峰面积的比值与异欧前胡素的浓度进行线性回归。

最低定量限(LLOQ)是信号与噪音的比值等于10时异欧前胡素的浓度，也是标准曲线最低浓度。

2.2.3 准确度和精密度 质量控制样本浓度为4.0，20，200和 800 ng/mL，准确度用质量控制样本实际测得的浓度与理论浓度的比值来表示。精密度由质量控制样本的相对标准偏差来表示。

2.2.4 提取回收率 使用质量控制样品测定提取回收率，并通过相同标准浓度下经提取的血浆样本和未经提取的标准样本的峰面积的比值进行计算。内标物的提取回收率用类似的方法计算。

2.2.5 基质效应 通过含有化合物的无药物血浆样品与溶解在甲醇中相同浓度化合物样品的峰面积比值来评估异欧前胡素和内标物的基质效应。分别对5个样品在不同浓度下(20，200，800 ng/mL)进行分析。

2.3 大鼠体内异欧前胡素的药代动力学研究

10只大鼠称重，分别以50 mg/kg的量给予异欧前胡素。异欧前胡素溶液用含3%的吐温80溶解制备，灌胃给药。血浆样品分别于给药后的0.2，0.35，0.5，0.75，1.0，1.5，2.5，3.5，5.0，8.0和12 h取样并放置于肝素化的试管中，在3 000 rpm下离心15 min，4 ℃。离心后抽取上清液100 μL移至1.5 mL的Eppendorf试管中，20 ℃保存，直到分析。

2.4 不同pH值下异欧前胡素稳定性研究

观察不同pH值下异欧前胡素的稳定性，用浓度1 mg/mL甲醇储备液制备浓度200 ng/mL异欧前胡素的水溶性缓冲液，在温度37 ℃下温育2 h。缓冲液的pH分别为2.0，4.0，6.0和 8.0。分别于20，30，50，70，90和120分钟整点收集溶液，通过每一时间点下峰面积与0点时峰面积之比来监测异欧前胡素降解程度。

2.5 异欧前胡素的溶解性和溶出度研究

口服药物制剂活性成分的溶解性在药物筛选中为关键因素之一，在进行溶出研究前，需要在仿生肠液中测定(pH 6.8)异欧前胡素的溶解性，将其加入10 mL液体中，恒温摇床温育2 h，整体积样品移出，过滤，在高效液相色谱下定量。

药物溶出/吸收仿生系统(图2)中溶液均由蠕动泵控制流速，流速为0.5 mL/min。药液转移至扩散膜一侧的供给室内。在溶出研究中，供给室内的溶液每隔10 min采集1次。异欧前胡素投药量为(5.0±0.5 )mg(n=3)。样品通过高效液相色谱进行分析。

2.6 数据分析

一级消除速率常数K按照下面的方程计算：

C0是药物的初始浓度，Ct是在时间点t时的剩余浓度。

大鼠体内异欧前胡素的药代动力学参数通过WinNonlin软件(Phoenix WinNonlin 6.0，Pharsight Corp.，Cary，NC，USA)计算。所得数据以均值±标准差(SD)表示。

3 结 果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性 方法专属性结果如图3所示，异欧前胡素和内标物的保留时间分别为4.3和3.26分钟，该时间没有内源性干扰物。

3.1.2 准确度和精密度 浓度为20，200和 800 ng/mL异欧前胡素的准确度和精密度见表1。不同浓度下的精密度的相对标准偏差范围分别为6.8%～8.0%。准确度范围为-15.3%～0.64%。结果表明，该方法准确度、精密度和重现性均符合要求。

表1 精密度和准确度[n=5，(均值±SD)ng/mL)]

3.1.3 提取回收率 异欧前胡素和内标物的提取回收率见表2。在4.0，20，200和 800 ng/mL浓度下，平均回收率大于50%，符合要求。

表2 异欧前胡素及内标物提取回收率考察结果(n=5)

3.1.4 基质效应 绝对基质效应通过血浆样品与溶解在甲醇中浓度为20，200和 800 ng/mL的异欧前胡素(n=5)和浓度为200 ng/mL内标物(n=5)峰面积比值来表示。空白血浆样品加入标准化合物备用，未发现明显的基质效应(见表3)。

表3 异欧前胡素及内标物基质效应(n=5)

3.2 药代动力学应用

异欧前胡素在大鼠体内平均血药浓度-时间曲线见图5。经WinNonlin 6.1软件，采用非房室模型拟合药代动力学参数。异欧前胡素相关药代动力学参数见表4。给药后(45±0.18)min，异欧前胡素达峰浓度，Cmax为(0.26±0.002)μg/mL。随后的1.5 h内血药浓度迅速下降，且在给药后1.5～12 h内消除速率趋于缓慢。血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-last)为(27.9±0.11)min·μg/mL。异欧前胡素(Vz/F)为(543.7±4.79)L/kg，表明其在组织内分布广泛。

3.3 不同pH下异欧前胡素稳定性

不同pH条件下异欧前胡素含量逐渐下降，在pH为2.0时下降尤为显著。120 min后，异欧前胡素的含量仅为24.9%；在pH为4.0、6.0和8.0时，剩余量分别为68.9%，64.7%和 53.5%，见图4A。在色谱分析中，检测到一种未知化合物(见图4B和C)。在pH为2.0和8.0的条件下，随着异欧前胡素的量逐渐下降，未知化合物的峰面积逐渐增加。该种未知化合物可能是一种降解产物，其结构还有待进一步验证。在不同pH下观察到的K范围分别是kpH=2.0kpH=8.0kpH=6.0kpH=4.0。根据所观察到的降解速率，pH值的顺序为pH 2.0pH 8.0pH 6.0pH 4.0。因此，异欧前胡素在酸性和碱性环境下是不稳定的，它的不稳定性可能导致了低血药浓度。

表4 异欧前胡素主要药代动力学参数(n=10)

3.4 异欧前胡素溶出特性

通过400多分钟观察，从DDASS研究中获得异欧前胡素不规则溶出曲线(见图6)，累积溶出百分率仅为(0.046±0.02)%，其累积溶出百分率与异欧前胡素不溶于水的特性一致。

4 讨 论

根据生物药剂学分类系统(biopharma-ceutics classification system，BCS)，异欧前胡素属于BCSII 类化合物，其具有低溶解度和高渗透特性。该类化合物的缓慢溶解可能是其吸收的限速步骤。为此，能够准确、快速的研究药物的溶出特征尤为重要。

本研究应用的DDASS法优势在于不仅考虑到胃肠道内急剧的pH变化，并且可以连续模拟药物在胃内的溶解过程，结果表明异欧前胡素的累积溶出百分率仅为(0.046±0.02)%，与大鼠体内药代动力学特征达峰血药浓度较低[Cmax=(0.26±0.002)μg/mL]，组织分布广泛 [Vz/F=(543.7±4.79)L/kg]等特征相符；通过在不同pH下的稳定性研究表明，随着pH值变化异欧前胡素含量减少，分别在2.0和8.0时不稳定性尤为明显(图5)。由此可以推断异欧前胡素血药浓度低，与其不稳定性和低溶解性有关，DDASS法能够快速、准确的为药代动力学行为提供依据。

(此文图1-6见附页1-2)

文见第1-4页

A:异欧前胡素;B:佛手柑内酯图1 异欧前胡素和佛手柑内酯化学结构图图2 药物溶出/吸收仿生系统

A：空白血浆；B：供试品色谱图
图3 异欧前胡素和佛手柑内酯与空白血浆供试品色谱图

图4不同pH下异欧前胡素降解时程(A)及在pH 2.0(B)和pH 8.0(C)下的实时色谱

图5异欧前胡素大鼠灌胃后血药浓度-时间曲线(n=10)

图6 在DDASS供给室内异欧前胡素的溶出过程