光固定明胶修饰的聚醚醚酮（PEEK）表面促进细胞增殖及成骨性研究

万腾 张郡 田海清 袁天阳 刘钦毅*

聚醚醚酮（PEEK）材料由于具有与人体骨骼相近的弹性模量、机械强度较高、生物相容性较好、X线可穿透及优良的自润性等独特的优势，其在整形外科、骨外科及口腔外科已得到了广泛的应用[1]。然而其材料表面的生物学惰性及疏水性严重限制了其进一步扩大应用[2]，并可导致患者术后出现骨折部位的延迟愈合甚至不愈合等并发症，给患者带来身体及经济上的负担。

明胶为胶原的一种降解产物[3]。作为一种天然的高分子化合物，其具有生物相容性、生物活性、免疫毒性较低等优点[4]。光固定明胶可通过紫外照射产生内部高分子交联粘附于材料的表面，具有广泛的粘附性[5]，增加材料的生物活性。本研究旨在通过光固定明胶粘附于PEEK材料表面，增加PEEK材料的生物活性。

1 材料与方法

1.1 光固定明胶及改性PEEK材料的制备

本研究中明胶的制备如以前的文献报道[6]。一定量的明胶（Sigma-Aldrich）溶于10 mL的去离子水中。25.8mg的（4-叠氮苯甲酸基）琥珀酰（Sigma-Aldrich）溶于20 mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（北京化工厂）中并与明胶溶液共混，4℃下磁力搅拌下过夜。将PEEK片放入上述溶液中，24h后取出PEEK片于紫外灯下照射5min。一次水反复冲洗未粘附的明胶。本研究采用的聚醚醚酮规格均为医用级PEEK（吉林中研科技公司）24孔板大小（面积2cm2）、厚度为0.1 cm。

1.2 材料性能表征学研究

⑴电子场发射扫描显微镜（SEM,S-4800,Hitachi）观察材料表面形态变化。

⑵静态水接触角： 采用悬滴法测试材料接触角变化（VCA 2000,AST），实验组及对照组均测试3个样品，每样品选区3个点进行测试。

1.3 细胞学研究

1.3.1细胞的培养

本实验采用鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）（吉林大学第二医院实验中心）在HG-DMEM培养基（（Dulbecco's modified eagle medium）（Sigma-Aldrich）中，于加湿、37℃、5%CO2环境中培养。

1.3.2 CCK-8法测细胞增殖

将材料用75%乙醇消毒30 min，无菌PBS液反复清洗3次。1mLMC3T3-E1细胞悬液（2×105/mL）种植于材料表面。采用CCK-8（Sigma-Aldrich）测试材料上第3、7天的细胞增殖情况。

1.3.3梯度脱水观察细胞形态

于24孔板内将1mL MC3T3-E1细胞悬液（2×105/mL）种植于材料表面，培养第 3天及第 7天后，吸弃培养基，PBS溶液清洗三遍，4%多聚甲醛室温下固定30 min，分别用50%、60%、70%、80%、90%、100%浓度的乙醇溶液脱水30 min后采用SEM观察细胞形态。

1.3.4碱性磷酸酶（ALP）测试

于24孔板内将1 mL MC3T3-E1细胞悬液（2×105/mL）种植于材料表面，培养第7天及第14天后，吸弃培养基，PBS溶液清洗三遍，每孔加入200uL细胞裂解液，-80℃反复冻融2到3次，采用BCA试剂盒测试总蛋白量，并于吸光度405 nm处测试ALP量，细胞分化使用ALP量/总蛋白量进行定量。

本研究应用SPSS1.30统计软件进行分析处理，计量资料以±s表示，并精确到小数点后三位，组建比较采用独立样本 检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEEK及光固定明胶改性PEEK表面SEM形态结果

如图1所示，可观察到粗糙的普通PEEK表面图1(A)，改性后可观察到光固定明胶粘附于PEEK表面图1(B)，且表面形态变得相对规则。

图1，SEM观察PEEK表面形态（A），表面黏附光固定明胶后表面形态（B）。

2.2 静态接触角改变

如图2，PEEK的静态接触角为99.7+3.752°(B)，表面粘附光固定明胶改性后静态接触角减少到43.2+4.375°(C)，表明表面粘附光固定明胶后PEEK亲水性明显增强。

图2，PEEK及光固定明胶改性后PEEK表面亲水性变化，(A)每组测试3个样品得出亲水性变化柱状图；（B）PEEK静态水接触角；（C）光固定明胶改性后PEEK表面接触角。p＜0.05,n=3。

2.3 细胞增殖

MC3T3-E1细胞在材料表面第3、7天细胞增殖情况如图3。PEEK组在第3天及第7天OD值相对于光固定明胶改性后OD值明显较低。表明经光固定明胶改性后PEEK促进细胞增殖能力增强，在第3天及第7天光固定明胶改性组OD值较对照组别分强加了33.7%及42.9%，PEEK表面生物活性明显增强。

图3，CCK-8法测试PEEK及光固定明胶改性后对细胞3天及7天增值的影响，光固定明胶改性后PEEK的生物活性明显增强p＜0.05。

2.4 细胞形态测定

通过 SEM观察细胞第3及第7天细胞形态如图4，在第3天未改性PEEK表面细胞形态仍呈现豆状的原始细胞形态，且几乎未发现细胞基质的分泌，光固定明胶改性组可发现细胞铺展成圆盘状或呈带状，细胞通过肌动蛋白及足丝蛋白粘附于材料表面，且发现大量细胞基质的分泌。对照组细胞伸展形态在第7天较第3天明显较好，细胞形态转变为圆盘状，且可观察到少量细胞基质分泌，细胞通过足丝蛋白及伪足黏附于PEEK表面。光固定明胶改性组细胞已完全伸展形成扁平状，部分细胞已被大量分泌的细胞基质覆盖，细胞牢固的粘附于材料表面，表明光固定明胶改性后PEEK的生物相容性明显增强。

图4，SEM观察MC3T3-E1细胞第3天及第7天形态：(A)PEEK组3天细胞形态；(B)光固定明胶改性组3天细胞形态；(C)PEEK组7天细胞形态；(D)光固定明胶改性组7天细胞形态。

2.5 碱性磷酸酶（ALP）定量测定

为了探究光固定明胶改性后PEEK对于前成骨细胞分化的影响，我们进行了碱性磷酸酶（ALP）定量测试，如图5，在第7天及第14天光固定明胶改性后实验组的ALP含量较对照组别分增强了5.1%及7.3%，说明通过光固定明胶改性后对于前成骨细胞的分化具有一定的促进作用。

图5，第3及第7天碱性磷酸酶（ALP）定量，可发现光固定明胶改性后PEEK对于细胞分化具有一定的促进作用。

3 讨论

随着聚醚醚酮（PEEK）在临床中的广泛应用，PEEK材料的疏水性及生物惰性等缺点引起了广大学者的注意[1,2,7]。目前PEEK材料的改性方式主要分为两种[8]：①通过在PEEK表面结合一些活性因子改善PEEK材料的表面生物活性；②通过将PEEK与一些生物活性物质共混，增加PEEK材料的生物活性。其中表面改性的方案由于能在增加PEEK材料生物活性的同时，保留了其力学性能较高、密度与人体骨骼相似、X线可穿透性及自润性等优点，为广大学者所认同[8]。

明胶为胶原的降解产物，其具有优良的生物相容性、生物降解性及低免疫毒性等。光固定明胶为目前应用较为广泛的生物活性基质。其目前已广泛应用水凝胶、担载生长因子、材料表面改性等医用材料，其临床应用前景较为可观。本研究采用光固定的方式将明胶粘附于PEEK表面，增加材料的生物活性。根据以往的研究表明光固定明胶的叠氮基团在紫外光照射激发下生成高反应活性的氮烯，这种高反应活性氮烯可与高分子材料表面的碳氢化物共价结合，从而使明胶通过共价结合牢固的粘附于材料表面[9]。Mojgan Heydari等人[10]采用钛片表面粘附光固定明胶的方法对钛片进行改性，研究结果发现改性后PEEK表面早期细胞粘附性、生物活性等明显增加。本研究方案中明胶也可有效的粘附于PEEK表面，并持久的改善PEEK表面生物相容性。

本研究采用PEEK表面改性的方案。通过电镜观察粘附光固定明胶后，PEEK材料表面发生类似细胞基质状物粘附于表面，表明采用该方案光固定明胶可粘附于PEEK表面，并且粘附光固定明胶的方法可使PEEK亲水性明显增加。目前研究表明材料表面亲水性的增强会促进细胞对于材料的早期粘附[11]，且目前研究发现表面粘附的光固定明胶的活性基团对胎牛血清等组织蛋白具有吸附性，表面组织蛋白的粘附会明显增强材料的生物活性[9]。在细胞学研究中采用CCK-8法对MC3T3-E1细胞第3及第7天细胞增殖进行了测定，发现光固定明胶改性组在第3及第7天OD值明显增高，细胞增殖明显较未改性 PEEK强，表明通过光固定明胶改性后PEEK可明显促进细胞增殖。通过SEM观察第3及第7天细胞形态发现通过光固定明胶改性后细胞铺展形态及基质的分泌都明显增强，细胞铺展可表明光固定明胶改性后对于细胞的早期粘附增强，细胞早期粘附是细胞功能化并最终组织化的重要标志，细胞增殖与新生骨的形成密切相关[12]，细胞基质为细胞间信息交流的一种方式，有效的细胞基质的分泌是细胞开始分化的标志。碱性磷酸酶（ALP）是细胞早期分化的标志，通过 ALP定量测试表明光固定明胶改性后PEEK对于细胞的早期分化具有一定的促进作用可促进新生骨的形成。

4 结论

本研究结果表明：光固定明胶可固定于聚醚醚酮（PEEK）表面，并改变PEEK的表面亲水性。细胞增殖、细胞形态、基质分泌及 ALP等细胞学研究表面，光固定明胶修饰于PEEK表面可明显增强其生物活性，为细胞生长提供良好的生物微坏境。