人参皂苷Rg1对新生鼠缺氧缺血性脑损伤海马神经元凋亡及学习记忆能力的影响

雷勋明

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE)是指围生期窒息缺氧导致脑的缺氧缺血性损害(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)而出现的一系列临床脑病表现，是围生期足月儿脑损伤的最常见原因，可引起脑性瘫痪、癫痫、智力低下等严重后遗症[1]。其主要病理改变为脑血管梗死及神经元凋亡、坏死，脑缺血后，因脑组织缺血缺氧，缺血中心区神经细胞发生急性坏死，而在缺血半暗带区，神经细胞则发生以凋亡为主的迟发性死亡，且凋亡在重新恢复血流供应后不会终止，这与缺血后脑组织损伤面积发展扩大有关[2]。因此，如何挽救濒死细胞、抑制细胞凋亡以及减少神经元死亡是脑缺氧缺血神经细胞损伤后保护治疗重点。人参皂苷Rg1是三七、人参的主要生物活性成分，其具有抗衰老、改善循环、改善神经功能障碍及行为异常、提高机体免疫力等作用[3]。在成人应用心血管疾病治疗较多，而在新生儿脑血管疾病中的应用报道较少，因此，该实验通过对新生鼠HIBD模型后注射人参皂苷Rg1，观察人参皂苷Rg1海马神经元凋亡及对其学习能力和记忆力的作用，为临床新生儿HIE的神经功能和认知行为障碍的康复提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物 15日龄SD乳鼠60只，体质量20～30 g，雌雄不限，由湖北医药学院实验动物中心提供[实验动物合格证号SCXK(鄂)2016-0005]，按随机数字表法分为HIBD组、三七皂甙Rg1低剂量组和三七皂甙Rg1高剂量组各20只，饲养环境温度22～25 ℃，相对湿度50%，自由饮食进水，分笼喂养。

1.2 实验方法 采用改良的Rice-Vannucci法制备HIBD模型[4]，三七皂甙Rg1高、低剂量组结扎左颈总动脉，HIBD组不结扎。三七皂甙Rg1低剂量组术后每天经腹腔注射人参皂苷Rg1(10 μg/g)，三七皂甙Rg1高剂量组注射人参皂苷Rg1(20 μg/g)，HIBD组每天一次注射相同剂量的生理盐水，共25 d。

1.3 记忆力和学习能力测试 各组大鼠在注射人参皂苷Rg1或生理盐水注射25 d结束后即开始进行测试：首先选一个安静暗室，每天固定在下午5～6点。Y-迷宫为一个三等臂式反射箱，三臂的夹角为120°，底部为可通电的铜棒，每臂端有一信号灯，灯亮表示安全区，此臂不通电无电流，另两臂通电(电压50～70 V，大致固定在能使小鼠产生逃避行为的强度)。实验时，随机变换安全区，电击小鼠，以小鼠立即逃往安全区为一次正确反应。具体方法：每只小鼠先在迷宫中适应3 min，每次电击延迟为5 s，直到小鼠的训练过程中连续9次正确反应即为学会。记录小鼠学会所需的训练次数，训练次数越少学习能力越好[5]。24 h后进行记忆保持能力的检测，以正确反应次数占总检测次数的百分比表示记忆保持能力(正确反应的次数/总检测次数×100%)。

1.4 海马神经元凋亡情况 采用TUNEL法检测实验鼠海马CA1区神经元凋亡情况[6]。在学习记忆力测试完成后，各组随机抽取5只实验鼠，分离双侧海马CA1区组织；常规电镜样品制备，TUNEL法观察海马CA1区神经元凋亡情况，严格按照试剂盒说明书进行操作；400倍显微镜下，每张切片任意选择5个视野进行观察，统计TUNEL阳性细胞总数，以细胞核出现棕黄染色颗粒为TUNEL阳性细胞。

2 结果

2.1 各组实验鼠学习能力及记忆力测试正确反应率比较 见表1。

表1 各组实验鼠学习能力及记忆力测试正确反应率比较

注：与HIBD组比较，aP<0.05；与人参皂苷Rg1低剂量组比较，bP<0.05。

表1结果表明，HIBD组学习能力及记忆力测试正确反应率均低于人参皂苷Rg1低剂量组和高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；人参皂苷Rg1低剂量组学习能力及记忆力测试正确反应率低于高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组实验鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数比较 见表2。

表2 各组实验鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数比较个)

注：与HIBD组比较，aP<0.05；与人参皂苷Rg1低剂量组比较，bP<0.05。

表2结果表明，HIBD组海马CA1区TUNEL阳性细胞数高于人参皂苷Rg1低剂量组和高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)；人参皂苷Rg1低剂量组海马CA1区TUNEL阳性细胞数高于高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

三七中含有多种皂苷，三七总皂苷是临床中成人心血管疾病应用较多的成分，具有抗氧化、抗衰老、减轻神经功能损伤的作用。研究表明，三七总皂苷能抑制细胞内钙离子超载，减少星形胶质细胞的活性氧产生[7]，上调缺血脑组织的神经元特异性烯醇化酶表达[8]。三七总皂苷可抑制受体中一氧化氮的过量产生，减轻缺氧缺血后的神经功能障碍，增加海马CA1区锥体细胞存活数，对脑缺氧缺血神经元起到保护作用[9]。人参皂苷Rg1是三七总皂苷中药理最为活性的成分。本研究结果显示，HIBD组海马CA1区TUNEL阳性细胞数高于人参皂苷Rg1高、低剂量组，人参皂苷Rg1低剂量组海马CA1区TUNEL阳性细胞数高于高剂量组，表明人参皂苷Rg1能减少新生鼠海马神经元凋亡，大剂量应用效果较好。有研究认为人参皂苷Rg1抗神经凋亡具体机制涉及MAPK通路[10-11]。

海马及其周围皮质是神经记忆通路的重要组成部分，海马锥体细胞层神经元的凋亡可能会导致严重的学习记忆障碍[12]。有报道电刺激、高压氧治疗可减少梗死灶及其周围的白细胞浸润，使氧自由基的产生减少，避免缺血后细胞的死亡，通过神经源性神经保护作用减轻脑损伤和促进脑功能恢复，提高其学习记忆能力[13]。本研究HIBD组学习能力及记忆力测试正确反应率均低于人参皂苷Rg1高、低剂量组，人参皂苷Rg1低剂量组学习能力及记忆力测试正确反应率低于高剂量组，表明人参皂苷Rg1能改善HIBD新生鼠的学习能力和记忆力，且与人参皂苷Rg1剂量有关，大剂量应用时效果较好。其机制与海马神经元内多巴胺、肾上腺素和5-羟色胺浓度以及脑内M受体浓度有关，这些神经递质可影响学习能力和记忆力[14-15]。

人参皂苷Rg1能减少新生鼠HIBD海马神经元凋亡，有效地改善HIBD新生鼠的学习能力和记忆力。然而，人参皂苷Rg1对HIBD海马神经元凋亡及学习、记忆力的影响机制尚需进一步验证。