黄连素对2型糖尿病大鼠大血管病变PI3K/Akt信号通路的影响

封 芬，谭安雄，邓集湘，周 斌

(1.邵阳学院 药学院，湖南 邵阳，422000； 2.邵阳市中心医院，湖南 邵阳，422000)

关健词：黄连素；糖尿病；大血管病变；PI3K；Akt

文献资料显示，我国已成为世界第一糖尿病大国，2013年，成人糖尿病患病率已高达10.4%[1]。糖尿病大血管病变是指由糖尿病并发的心、脑血管及外周血管病变，接近65%的2型糖尿病患者死于大血管病变，其病理变化主要表现为血管内皮功能异常和动脉粥样硬化[2]。黄连素(Berberine)是我国传统中药，近年来发现其具有显著的降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗等功效[3-5]。据报道，黄连素可抑制兔颈动脉球囊损伤后新生内膜增生，改善血管内皮功能，发挥对血管内皮的保护作用[6]。但目前国内外文献中，关于黄连素对糖尿病大血管保护作用的机制研究鲜有报道。近年研究显示，PI3K/Akt信号通路参与了胰岛素信号的传递，高浓度葡萄糖能抑制人脐静脉内皮细胞Akt和eNOS mRNA表达[7]。故推测黄连素有可能通过PI3K/Akt信号通路参与糖尿病大血管的保护作用，本实验通过研究黄连素对糖尿病大血管病变PI3K/Akt信号通路的影响，为黄连素防治糖尿病大血管病变发生发展提供理论基础及实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及饲料

雄性SD大鼠60只，体重180～200克，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002；普通饲料(粗脂肪7.5%、粗蛋白24.3%、碳水化合物46.5%)；高脂饲料(含1%胆酸、2.5%胆固醇、10%炼猪油、20%蔗糖、66.5%普通饲料)购自湖南长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 药物与试剂

链脲佐菌素(STZ)及黄连素(北京北实纵横科技发展有限公司)；二甲双胍(山东东方福瑞达制药有限公司)；C反应蛋白ELISA检测试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司)；p-PI3Kp85一抗(Cell Signaling Technology公司)；p-Akt(Ser473)一抗、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(江苏碧云天生物技术研究所)；β-actin抗体、PVDF膜(北京索莱宝科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)，化学发光试剂盒(Santa Cruz公司)。

1.3 主要仪器

Sure Step Plus血糖仪(Lifescan公司)，聚丙烯酰胺垂直电泳及转膜系统、Elx800酶免疫仪(Bio Rad公司)，高速冷冻离心机(Eppendorf公司)，超低温冰箱(三洋公司)，Chemi-Doc-IT610化学发光成像系统(UVP公司)。

1.4 动物造模及分组

清洁级雄性SD大鼠60只，随机抽选10只作为正常组，饲喂普通饲料，其余大鼠饲喂高脂饲料。4周后，高脂饲料组大鼠禁食12h后腹腔注射STZ(30mg·kg-1，用pH4.4的0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液溶解)，7天后重复注射一次。正常组在同等情况下腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。2周后，断尾取血检测禁食12h后的空腹血糖(FBG)，以FBG≥7.8mmol·L-1为2型糖尿病大鼠造模成功的标准[8]。将造模成功的大鼠(n=30)随机平均分为模型组、黄连素组和二甲双胍组。模型组以生理盐水灌胃(10ml·kg-1·d-1)，黄连素组以黄连素灌胃(150mg·kg-1·d-1)，二甲双胍组以二甲双胍灌胃(200mg·kg-1·d-1)，继续喂养8W。

1.5 标本收集

药物干预结束后，剪尾采血检测FBG。然后腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(40mg·kg-1)麻醉大鼠，腹主动脉取血4～5ml，低温高速离心后取血清，于-80℃保存。取血之后立即分离胸主动脉，剪成两段，分别于HE染色和-80℃保存。

1.6 空腹血糖及血清C反应蛋白的检测

用血糖仪检测大鼠FBG，按试剂盒说明书操作步骤检测血清C反应蛋白(CRP)水平。

1.7 形态学观察

将大鼠胸主动脉用10%中性甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，浸蜡，石蜡包埋，按4μm厚度连续切片，HE染色，光镜下察看其形态学变化。

1.8 胸主动脉p-PI3Kp85、p-Akt表达检测

取大鼠胸主动脉，加入RIPA裂解液(10μl·mg-1)和PMSF(1μl·mg-1)，于冰浴条件下匀浆，而后4℃，12000r·min-1离心5min，去除沉淀，按BCA试剂盒操作检测蛋白总量。取50μg蛋白加入上样缓冲液，加热变性，然后在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳(浓缩胶为80V恒压，分离胶为120V恒电)。半干式电转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，在室温下轻摇2h后加入一抗4℃孵育过夜。次日TBST洗膜3次后(每次10min)加入二抗，37℃孵育45min。经TBST洗膜3次后(每次20min)，于暗房内加ECL发光剂，曝光、显影、成像。用Image J图像分析软件分析免疫印迹结果，以β-actin蛋白灰度值为参考，计算p-PI3Kp85、p-Akt的相对含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况

实验期间，正常组大鼠生长良好，毛皮光泽，自主活动正常，无死亡。模型组大鼠毛皮枯黄，萎靡少动，饮食饮水增加，小便排泄增多。黄连素组及二甲双胍组大鼠用药干预后，糖尿病症状明显减轻，精神状态良好，皮毛润泽，自主活动无异常。

2.2 大鼠FBG及血清CRP水平

与正常组比较，模型组FBG及CRP水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，黄连素组及二甲双胍组FBG及CRP水平明显降低(P<0.01)。黄连素组与二甲双胍组的FBG及CRP水平无统计学差异,见表1。

组别剂量/(mg·kg-1)FBG/mmol·L-1CRP/mg·L-1正常组 —4.62±0.291.34±0.11模型组 —13.54±0.21*2.78±0.18*二甲双胍组2008.01±0.42△1.88±0.14△黄连素组 1508.9±0.38△1.91±0.15△

注：与正常组比较，*P<0.01，与模型组比较，△P<0.01

2.3 大鼠胸主动脉内皮形态学观察

正常组胸主动脉内膜光滑平整，中膜层平滑肌细胞排列整齐。模型组内膜断裂不平整，连接间隙增大，内皮细胞有坏死脱落。与模型组相比，黄连素组及二甲双胍组各层细胞排列较规则，内膜较光滑平整，内皮细胞无坏死脱落，病变明显减轻,见图1。

注：A为正常组，B为模型组，C为二甲双胍组，D为黄连素组图1 黄连素对大鼠胸主动脉形态学的影响(HE染色，×200)Fig.1 The effect of berberine on the histological morphology of rats’ thoracic aorta by HE staining(×200)

2.4 大鼠胸主动脉p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表达

免疫印迹结果显示各蛋白与β-actin的分析光密度平均比值中，与正常组相比，模型组胸主动脉p-PI3Kp85、p-Akt的表达明显降低(P<0.01)；与模型组相比，黄连素组和二甲双胍组胸主动脉p-PI3Kp85、p-Akt的表达明显增高(P<0.01)；黄连组和二甲双胍组p-PI3Kp85、p-Akt的表达无统计学差异，见图2。

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01图2 黄连素对大鼠胸主动脉p-PI3Kp85和p-Akt蛋白表达的影响±s，n=10)Fig.2 The effects of berberine on protein expression of p-PI3K p85 and p-Akt by western blot analysis in rats’aorta(±s，n=10).*P<0.01vs normal group;△P<0.01vs model group

3 讨论

糖尿病血管并发症主要表现为全身的血管损害，包括微血管病变和大血管病变，是糖尿病最常见的慢性并发症。糖尿病血管并发症的严重程度直接关系到糖尿病患者的预后及生活质量。因此，深入研究糖尿病大血管病变的发生机制，对于控制和延缓其病理过程意义重大。本实验采用高脂高糖饲料喂养，结合小剂量STZ腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型[8]。此种造模方法操作较为方便，成模时间较短，可重复性较好，广泛用于2型糖尿病发病机理的相关研究。在实验期间模型组大鼠出现了典型的多食、多饮、多尿等糖尿病症状，黄连素组应用黄连素灌胃治疗干预后，上述症状明显减轻。

黄连素又称为小檗碱，属于异喹啉类生物碱，可从中药黄连、黄柏等提取，临床上一直作为非处方药用于治疗腹泻。近年来，国内外学者发现黄连素在内分泌、心血管及中枢神经系统显示出有益的药理活性及功效[9]。据报道，黄连素能显著降低空腹血糖，通过抑制肝糖异生作用，改善糖尿病大鼠糖代谢[10]。Wang J等发现，黄连素短期应用可通过局部抑制肠DPP-Ⅳ而降低STZ诱导糖尿病大鼠模型FBG及餐后2h血糖[11]。本实验结果显示黄连素组大鼠FBG水平明显低于糖尿病组，说明黄连素灌胃治疗干预后，能有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖(P<0.01)，与国内外报道一致。

C反应蛋白(C-reactive protein，CPR)是一种非糖基化的聚合蛋白，它的生物学作用主要包括识别和结合内源性异物、激活补体、调节吞噬细胞活性等，为非特异性的炎症标记物，是炎症急性期时最灵敏的指标之一。Lowe G等认为，炎症因子水平紊乱是引起血管内皮细胞功能损伤的重要诱因[12]。研究表明，血清CRP水平与糖尿病大血管病变之间存在着明显的相关性，高血糖及高血脂可通过增加血管内皮细胞通透性，引起内皮功能损伤，使CRP等相关炎症因子水平紊乱[13]。据报道，黄连素对软脂酸引起的血管内皮细胞损伤有显著的保护作用，并可能与上调eNOS、促进NO生成有关[14]。诸多研究显示，黄连素在保护血管方面有积极意义。本实验结果中，模型组大鼠血清CRP水平显著增高(P<0.01)，HE染色显示大鼠胸主动脉内膜受损，提示糖尿病模型大鼠大血管出现炎性病变。黄连素组用黄连素干预治疗8周后，大鼠血清CRP水平明显低于模型组(P<0.01)，胸主动脉内膜病变也轻于模型组，提示黄连素能有效减轻血管炎性反应，在防治糖尿病大血管病变方面有积极作用。

磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)信号通路参与细胞膜转运、分泌和细胞生存、代谢、凋亡等多种细胞功能的调控。PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异二聚体[15]，调节亚基p85结合磷酸化的酪氨酸残基之后，活化催化亚基p110，从而传导酪氨酸激酶信号。Akt(蛋白激酶B)是PI3K信号通路下游的重要靶蛋白，PI3K/Akt信号通路在胰岛素调控血糖平衡方面发挥着重要作用[16]。研究表明，糖尿病患者Akt活化受损，黄癸固体分散体中的有效成份黄连素能上调Akt活性，促进葡萄糖转运蛋白4膜转位，改善胰岛素抵抗[17]。徐明国等报道，黄连素抑制TNF-α诱导的内皮祖细胞损伤与激活PI3K/AKT/eNOS途径有关[18]。本实验结果显示，模型组胸主动脉p-PI3Kp85、p-Akt的表达明显低于正常组(P<0.01)，而黄连素组用黄连素灌胃治疗8周后，p-PI3Kp85、p-Akt的表达明显高于模型组(P<0.01)。基于相关文献报道和本实验的初步研究结果认为，黄连素能降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖，改善大血管病变的病理过程，对糖尿病大血管具有保护作用，此作用机制可能与上调PI3K/Akt信号通路有关。

糖尿病大血管病变所涉及的信号通路错综复杂，本实验仅初步探讨了黄连素对糖尿病大鼠大血管PI3K/Akt信号通路的影响，其中各项指标间的因果联系还待研究。此外，黄连素对糖尿病大血管的保护作用是否涉及到其他机制也需要进一步的探索，以期为2型糖尿病大血管病变的防治用药提供更广泛的思路空间。