虎杖苷对动脉粥样硬化大鼠血脂的调节和CD36、VCAM-1表达的影响

刘君花，欧阳恩鸿，贺志明，魏海谅，罗湘军

(1.邵阳学院 附属第二医院，湖南 邵阳,422000；2.邵阳学院 药学院，湖南 邵阳,422000； 3.邵阳学院 医学院，湖南 邵阳,422000)

虎杖苷又名白藜芦醇苷，广泛用于心血管疾病的治疗，已有文献报道其降血脂作用[1]，但对其降血脂机制报道较少。本实验通过建立大鼠动脉粥样硬化模型，探讨虎杖苷对其血脂的调节作用，与对CD36、VCAM-1表达的影响，以期为虎杖苷开发成为调血脂、抗动脉粥样硬化药物提供理论依据。

1 材料

1.1 药物及试剂

虎杖苷(上海纯优生物科技有限公司提供，含量>98%)；辛伐他汀(杭州默沙东制药有限公司)；TC试剂盒，TG试剂盒，HDL-C试剂盒，LDL-C试剂盒，均由sigma公司提供。

1.2 仪器

J-25型高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)，酶标仪(Model 680)：BIO-RAD公司。

1.3 动物

雄性SD大鼠，体重200～250g，金丰实验动物繁育有限公司(济南)。

1.4 高脂饲料

81.3%基础饲料，10%猪油，5%白糖，3%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，以上饲料均购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司。

2 方法

2.1 动物分组及模型建立

SD大鼠60只，随机分为2大组：普通饲料组(正常对照组，n=10)和高脂饲料组(n=50)，普通饲料组给予普通饲料，高脂饲料组给予高脂饲料。喂养4周后，眼眶取血，测定血脂。高脂饲料组按血脂水平随机平均分成5组：(1)模型组：蒸馏水，ig 5mg·kg-1·d-1；(2)阳性药物组：辛伐他汀，ig 5mg·kg-1·d-1；(3)虎杖苷高剂量组：虎杖苷，ig 160mg·kg-1·d-1；(4)虎杖苷中剂量组：虎杖苷，ig 80mg·kg-1·d-1；(5)虎杖苷低剂量组：虎杖苷，ig 40mg·kg-1·d-1。从第5周开始，分组给予以上药物(或蒸馏水)，正常对照组以普通饲料喂养，高脂饲料组给予高脂饲养，饲养8周。

2.2 体重测定

测定大鼠体重，记录大鼠体重变化，测定时间分别为造模前及造模后第 4周、8周、12周。

2.3 血脂测定

造模后第12周，眼眶采血，分离血清，依试剂盒说明书操作，检测相应指标浓度。

2.4 组织形态学观察

造模后第12周，处死大鼠。取大鼠肝脏，以4%多聚甲醛液固定、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。

2.5 CD36与VCAM-1表达检测

末次给药后，处死实验大鼠，取主动脉3～5cm，以PBS冲洗，再用4%甲醛固定。冰冻切片后，冷丙酮固定10min后晾干。以PBS液冲洗3次，每次2min。加山羊血清封闭，在室温下孵育10min。倒掉血清后，分别加入VCAM-1和CD36一抗，在37℃条件下孵育1h。PBS冲洗3次，每次2min。加入快速免疫组化Max Vision TM二抗，再在室温条件下孵育10～15min。以PBS冲洗3次，每次冲洗2min。加入新配显色剂(DAB)，显色3～5min后，置显微镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染细胞核，流水冲洗返蓝。梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照组中以PBS缓冲液替代一抗。以免疫组织化学法测定试样中VCAM-1和CD36的表达。利用康克新柏图文分析软件进行图像分析。

2.6 统计方法

3 结果

3.1 大鼠体重

正常对照组大鼠体重随饲养时间增加而增加，模型组大鼠体重也有增加，但相比正常对照组增长缓慢，且具有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，辛伐他汀组、虎杖苷高剂量组的大鼠体重略有增加；但与正常对照组相比，无显著性差异，结果见表1。

组别剂量/(mg·kg-1)体重/g给药前4周8周12周正常对照212.5±13.0290.6±25.3314.3±18.0386.2±16.5模型 201.8±11.0217.9±16.6**225.4±15.0**230.2±10.4**辛伐他汀5199.7±8.9217.2±18.4229.6±14.6241.8±20.6#虎杖苷 160206.7±13.0220.3±15.6228.0±19.0241.9±20.8虎杖苷 80210.0±11.6216.2±15.7224.0±7.8228.2±15.7虎杖苷 40204.6±11.8225.6±16.2228.1±8.9224.5±15.9

注：与正常对照组相比：* *P<0.01；与模型组相比：#P<0.05

3.2 大鼠血脂

结果显示，模型组大鼠血清中的TC、TG、LDL-C明显升高(P<0.01)，而血清中的HDL-C含量却明显降低(P<0.01)，与正常对照组相比，具有显著性差异；与模型相比，虎杖苷组中大鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低，HDL-C明显升高(P<0.05或P<0.01)，且具有一定剂量相关性，结果见表2。

组别剂量/(mg·kg-1)TG/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)正常对照0.538±0.100**1.542±0.100**0.554±0.091**1.403±0.144**模型1.940±0.0862.782±0.2671.432±0.1130.886±0.056辛伐他汀51.814±0.076**2.492±0.321*0.803±0.116**1.329±0.167**虎杖苷1601.753±0.078**2.256±0.099**0.874±0.046**1.298±0.110**虎杖苷801.814±0.089**2.524±0.104*1.084±0.040**1.004±0.111*虎杖苷401.831±0.089*2.608±0.1181.298±0.108*0.968±0.114

注：与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05。

3.3 大鼠肝脏形态学观察

肉眼条件下观察：正常对照组大鼠肝脏为均匀暗红色，具光滑质感。模型组肝脏为黄褐色，具油腻质感。辛伐他汀与虎杖苷各剂量组的肝脏形态改变不明显。HE染色后置光镜下观察：正常对照组大鼠肝脏肝小叶结构正常，可见放射状肝索排列整齐，胞核清晰可见，脂肪变性与炎症细胞浸润病变不明显；模型组大鼠肝脏脂肪变性明显，肝小叶结构呈破坏状，肝索排列不规则，肝细胞肿胀明显，有大量脂肪积累在细胞中；辛伐他汀组与虎杖苷高、中剂量组大鼠肝细胞脂肪变性轻微，脂滴、空泡样变少见，结果见图1。

正常对照组 模型组 辛伐他汀5mg·kg-1

虎杖苷160mg·kg-1 虎杖苷80mg·kg-1 虎杖苷40mg·kg-1图1 各组大鼠肝组织病理学观察(HE染色×200)Fig.1 Histopathological observation of livers in each group(HE staining×200)

3.4 大鼠血管内皮细胞CD36的表达

造模后12周，模型组CD36 表达水平明显升高；辛伐他汀组、虎杖苷高、中剂量组中大鼠血管内皮细胞CD36 表达水平明显降低，与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)；虎杖苷低剂量组CD36 表达水平有所降低，但与模型组相比，差异不明显。结果见表3。

组别剂量/(mg·kg-1)平均光密度值正常对照5306±368**模型 9128±336辛伐他汀56086±656**虎杖苷 1606465±384**虎杖苷 806912±368**虎杖苷 408034±464

注：与模型组比较，**P<0.01

3.5 大鼠血管内皮细胞血管细胞黏附分子(VCAM-1)的表达

造模后12周，模型组VCAM-1表达明显升高;辛伐他汀组、虎杖苷高、中剂量组中大鼠血管内皮细胞VCAM-1表达水平明显降低，与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)；虎杖苷低剂量组VCAM-1表达水平有所降低，但与模型组相比，差异不明显。结果见表4。

组别剂量/(mg·kg-1)平均光密度值正常对照5806±472**模型 9203±312辛伐他汀56406±762**虎杖苷 1606615±376**虎杖苷 807142±382**虎杖苷 408834±476

注：与模型组比较：**P<0.01

4 讨论

大量研究表明，血浆TC、TG、LDL-C水平过高对AS的形成和发展有促进作用，而高水平的HDL-C可抑制AS的形成和发展[2]。本实验结果显示，虎杖苷高、中剂量可明显降低血清TC、TG、LDL-C水平，显著升高血清HDL-C水平，可明显改善、调节脂质代谢失调；组织形态学结果显示，虎杖苷可减少胆固醇蓄积，避免肝脏脂肪沉积，防止肝脏弥漫性脂质病变。VCAM-1表达于动脉内皮表面[3]，其主要作用是促使单核细胞与内皮细胞黏附[4]，从而促进AS的形成和发展：在VCAM-1介导作用下，单核细胞黏附血管内皮细胞，进入动脉内膜，继而分化成巨噬细胞，在动脉粥样硬化形成过程中发挥了极其重要的作用；清道夫受体CD36分布于血管内皮细胞表面，是主要的ox-LDL受体[5]，其作用是内吞ox-LDL，形成泡沫细胞，影响泡沫细胞移动，进而触发炎症级联反应，形成斑块。在AS的早期病变程中，CD36参与了泡沫细胞的形成、炎症介质的释放和血栓的形成[6]，它的表达影响泡沫细胞形成及斑块内脂质的沉积，进而影响斑块的稳定性。本实验通过以高脂饲料喂养建立大鼠动脉粥样硬化模型，考察虎杖苷对大鼠血管内皮表面VCAM-1和CD36表达的影响，实验结果表明，虎杖苷能够抑制AS大鼠血管内皮细胞VCAM-1和CD36表达。提示虎杖苷能够抑制VCAM-1参与的单核细胞与内皮细胞黏附，减少清道夫受体参与的巨噬细胞内吞，减少泡沫细胞形成，防止动脉粥样硬化早期形成动脉斑块，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

本课题组的另一研究结果表明，虎杖苷能平衡血脂代谢、干预炎症反应与调节NO的产生，抑制ox-LDL形成，减轻氧化应激反应；本实验结果显示：虎杖苷能抑制AS模型大鼠血管内皮细胞中VCAM-1和CD36的表达，抑制VCAM-1参与的细胞黏附，对抗CD36介导的巨噬细胞内吞过程，发挥对实验性大鼠AS的干预作用。综合以上结果提示，虎杖苷具有干预动脉粥样硬化的形成与发展作用，其机制可能与调节VCAM-1和CD36的表达有关，具体机制还需深入探讨，其干预动脉粥样硬化作用值得进一步研究。