p53、β—连环蛋白与IL—10联合检测对EB病毒相关性胃癌患者的预后评估的临床研究

汪维佳 廖志波

【摘要】 目的：以EB病毒相关性胃癌患者为研究对象，探究IL-10作为EB病毒型胃癌筛选生物标志物的可能性以及p53和β-连环蛋白水平对患者治疗后预后评估的价值。方法：纳入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手术治疗的EB病毒型胃癌患者80例，采集患者血液和少量肿瘤组织；采用Trizol法从新鲜冷冻的肿瘤组织中提取DNA，检测EBV DNA，扩增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清学检测抗体水平；采用免疫组织化学法检测肿瘤组织p53蛋白、β-连环蛋白表达及定位情况；采用双抗体夹心ELISA法检测血样中的IL-10水平；采用COX模型进行生存分析。结果：胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）、IL-10水平均显著高于对照组（t=12.441、11.832，P<0.001）；p53的阳性表达与低癌细胞分化状态、高T分期均存在显著相关（P<0.01），与有淋巴结转移也有密切聯系（P<0.01）；β-连环蛋白的阳性表达与低癌细胞分化状态、淋巴结转移之间有着密切联系（P<0.01）；在6～24个月的随访观察期间，p53阳性患者、β-连环蛋白阳性患者的生存时间均显著短于阴性患者（P<0.05）。结论：p53、β-连环蛋白与IL-10联合检测对EB病毒相关性胃癌的早期诊断和疾病预后评估具有临床运用价值。

【关键词】 p53； β-连环蛋白； IL-10； EB病毒； 胃癌

【Abstract】 Objective：To investigate the possibility of IL-10 as a biomarker for EB virus type gastric cancer and evaluate the prognostic value of p53 and β-catenin in the prognosis of patients with EB virus associated gastric cancer.Method：80 patients with type EB virus from January 2014 to December 2015 in our hospital underwent surgical treatment of gastric cancer，the patients blood and a small amount of tumor tissue were collected.DNA was extracted from fresh frozen tumor tissue by Trizol method，EBV DNA was detected，EBNA-2 gene was amplified and antibody level was detected by serology.Detection of the expression and localization of p53 protein，β-catenin in tumor tissues by immunohistochemistry；double antibody sandwich ELISA method was used to detect the level of IL-10 in blood samples；COX model was used for survival analysis.Result：The serum levels of IL-10 against EBV nuclear antigen in gastric cancer patients were significantly higher than those in control group（t=12.441，11.832，P<0.001）；the positive expression of p53 was significantly correlated with the differentiation of low cancer cells and the high T stage（P<0.01），and had a close relationship with lymph node metastasis（P<0.01）.The positive expression of β-catenin was closely related to the low differentiation of cancer cells and lymph node metastasis（P<0.01）.During 6-24 months follow-up，the survival time of β-catenin positive patients was significantly shorter than that of negative patients（P<0.05）.Conclusion：The combined detection of p53，β-catenin and IL-10 has clinical value for the early diagnosis of EB virus related gastric cancer and the evaluation of the prognosis of the disease.

【Key words】 p53； β-catenin； IL-10； EB virus； Gastric cancer

First-authors address：The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University·Yuedong Hospital，Meizhou 514733，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.11.008

胃癌是世界范围内发病率在前五的癌症之一，且是癌症相关死亡率第三的癌症。根据癌症聚类研究网站（Cancer Atlas Research Network）数据显示，胃癌分为4类，包括：EB病毒（EBV）阳性胃癌、微卫星不稳定型胃癌、基因组稳定型胃癌和染色体不稳定型胃癌。世界上每年有超过95万例的胃腺癌被诊断出来，估计这些病例中有10%患者与EBV感染有关[1-3]。据估计，全球每年约有84 000例EBV相关胃癌被诊断出。EBV阳性的胃癌类型构成EBV相关癌症中最大的组成部分。尽管如此，现有的文献中关于胃癌患者血清学成分分析的研究报道尚少[4]。在Chen等[5]的荟萃分析中，仅检索发现4篇文献进行比较胃癌患者与健康志愿者之间血清抗EBV抗体存在的差异。EBV感染相关的特定血清学标志物是监测暴露于EBV感染和再激活的有效生物标志物指标。例如，EB病毒衣壳抗原（EBVCA）提示存在潜伏感染，抗EB病毒核抗原（EBNA）和抗早期抗原（EA）提示潜伏感染再激活。此外，许多研究表明免疫抑制细胞因子，如IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）在某些类型的癌症中诱导EBV再激活，在肿瘤进程中发挥了重要作用[6]。最近来自癌症基因组图谱（TCGA）的数据揭示EBV相关肿瘤存在PIK3CA突变、PD-L1/2过表达、EBV-CIMP和CDKN2A沉默表达，以及免疫细胞信号传导等分子水平特征[7]。同时，EBV感染可通过致癌途径的激活导致宿主细胞的肿瘤发生和恶性转化事件。文献[8]研究证实，基因改变可能在EBV感染的发病机制中起重要作用，包括促进病理改变（譬如胃癌）。目前研究表明，p53、β-连环蛋白和人表皮生长因子受体2（HER2）均与EBV相关性胃癌的发病机制存在密切关系。因此，研究这些分子改变可能为EBV相关胃癌治疗靶点提供潜在的新型生物标志物且为治疗预后的评估提供参考依据。本研究以EB病毒相关性胃癌患者为研究对象，探究IL-10作为EB病毒型胃癌筛选生物标志物的可能性以及p53和β-连环蛋白水平对患者治疗后预后评估的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2014年1月-2015年12月于本院外科接受手术治疗的EB病毒型胃癌患者80例，所有患者均为幽门螺杆菌阴性。纳入标准：（1）符合胃癌诊断标准；（2）手术治疗前未进行放疗和化疗；（3）EB病毒检测阳性；（4）符合手术治疗指针。排除标准：（1）有严重心、脑、呼吸系统疾病，无法进行手术治疗；（2）存在其他严重并发症。同时纳入由同一病房因胃癌以外的疾病住院的50例患者组成对照组。本研究获本院伦理委员会的批准，所有纳入研究的志愿者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR 采集患者血液和少量肿瘤组织保存于-80 ℃冰箱。采用Trizol法从新鲜冷冻的肿瘤组织中提取DNA，检测EBV DNA，扩增EBNA-2基因（巢式PCR）和血清学检测抗体水平。根据文献[9]所述，根据外显子3上的EBV LMP-1亚型的PCR结果进行筛选鉴定，野生型为wt-LMP-1、缺失型为del-LMP-1。

1.2.2 免疫组化 将适量胃癌组织置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，而后进行常规脱水、透明及浸蜡处理；使用莱卡包埋机进行包埋石蜡块，RM2016切片机进行连续石蜡切片，厚度5 μm。石蜡切片置于65 ℃烤箱中过夜，而后梯度脱蜡、水化。水化后的组织切片上滴加3%过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶；而后切片进行酸性修复，采用预先配置好的柠檬酸盐缓冲液，切片置于液体中，采用微波加热法进行。待修复结束后予以1%BSA室温封闭30 min，加一抗于4 ℃过夜（p53：1∶800，abcam；β-连环蛋白：1∶200，abcam）。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶200）于组织切片，室温孵育1 h。采用DAB显色后，苏木素染核1 min，而后进行脱水和中性树脂封片。采用正置显微镜观察切片阳性信号，并进行计数统计。免疫组织化学结果定义如下：在至少50%的肿瘤细胞核中存在强p53于核表达被认为阳性结果，在至少10%的细胞质核中存在强β-连环蛋白表达被定义为阳性结果。免疫组织化学分析同时由两位病理科医生进行。

1.2.3 ELISA法检测IL-10 于清晨分别采集80例患者与50例健康志愿者的外周血5 mL，即刻送检，利用双抗体夹心ELISA法检测血样中的IL-10水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0（SPSS Inc，Illinois，USA）统计分析软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，组间方差不齐用校正t检验。相关性分析采用卡方检验，生存分析采用COX检验。定义P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组的年龄、性别、吸烟、EB相关抗体阳性比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。80例胃癌患者的相关特征参数分析， GTNM（G為癌细胞分化等级，T为肿瘤组织大小分级情况，N为淋巴结转移情况，M为转移情况）分级情况：G1 18例、G2 42例、G3 20例，T1 16例、T2 48例、T3 16例，N0 30例、N1 23例、N2 17例、N3 10例，M0 80例；癌灶部位分布情况：幽门部39例，胃体22例，贲门部59例；EB病毒类型：野生型（wt-LMP-1）59例，缺失型（del-LMP-1）21例。

2.2 两组血清IL-10、EBNA的表达水平比较 胃癌患者血清抗EB病毒核抗原（EBNA）水平显著高于对照组（P<0.001）；同时，检测发现EB病毒相关的胃癌患者血清IL-10水平明显高于健康志愿者水平（P<0.001），见表2。

2.3 p53、β-连环蛋白与EB型胃癌临床参数相关性 在80例肿瘤组织中进行p53的免疫组织化学染色，其中20个（25.0%）组织测试为阳性。p53的阳性表达与低癌细胞分化状态、高T分期均存在显著相关（P<0.01），与淋巴结转移也有密切联系（P<0.01）。同时，对80例肿瘤组织进行β-连环蛋白表达的检查，结果显示：β-连环蛋白的阳性表达与低癌细胞分化状态、淋巴结转移之间有着密切联系（P<0.01）。见表3、4。

2.4 生存分析 采用COX函数对80例患者进行生存分析，分别分析p53阳性、β-连环蛋白的阳性胃癌患者与阴性患者之间生存情况差异。统计分析结果显示，在6～24个月的随访观察期间，p53、β-连环蛋白阳性患者的生存时间均显著短于阴性患者，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1、2。

3 讨论

胃癌的发病率在世界范围内均呈现上升趋势，其中EB病毒相关性胃癌常见于中青年群体。EBVa胃癌（GC）在年龄50～68岁的患者中更常见，而EBV阴性胃癌在56～72岁患者中更为常见[10]。目前研究已经确定的促进EBVaGC发生的几个危险因素，譬如吸烟。在本研究中，60岁以上的男性占据62.5%，其中大多数（62.5%）是吸烟者。EBV在世界范围内普遍存在，大约95%的人群可被检测到EBV相关抗体的存在。据统计，EBNA IgG和EBVCA IgG在癌症患者和对照组中均比其他抗体检测更为频繁[11-12]。在本研究中，胃癌组和对照组中的抗EBVCA和抗EBNA的检测率相接近，尽管两个抗体的滴度在各组之间存在差异，这提示两者在EBVaGC患者中表达水平更高。此外，本研究中72.5%的GC患者中发现抗EA抗体，且50%患者抗体滴度检测呈现高效价，而在对照组中仅在8.0%中检测到，且是低滴度水平。因此，同时具有高抗EBVCA和抗EBNA水平的高抗EA效价可能提示GC患者存在EBV感染的再激活。

免疫抑制因子（如IL-10）在肿瘤进程中发挥重要作用。EB病毒可表达分泌IL-10因子（vIL-10），其与人IL-10（hIL-10）存在高度同源性，EB病毒在裂解期后期以及在B淋巴细胞感染发作时可分泌大量vIL-10，导致患者血清IL-10水平明显上升[13]。此外，文献[14]研究表明，IL-10水平在GC患者血清中高于对照组，因此可用于预测GC发生，特别是可用于评估疾病进展。

据报道，p53的突变与胃癌的发生发展阶段存在密切相关，且EBVaGC组织中晚期和p53过表达之间存在关联[15]。然而目前尚对p53与GC预后之间关联性的研究报道尚少。迄今为止，免疫组织化学检测p53表达对胃癌预后的影响仍然存在争议，一些研究将p53表达缺失与更长的生存期联系起来，这意味着p53是一个负面的预后因素。相反，其他研究表明，未发现p53表达与生存率之间的关系[16-17]。本研究结果表明p53阴性患者存在更长的生存时间。β-连环蛋白已被证明是Wnt信号级联反应的重要介质[18]。作为Wnt信号通路中的一个中心分子，β-连环蛋白表达位于膜，细胞质和细胞核中。细胞质和细胞核β-连环蛋白主要参与Wnt信号通路的调节。β-连环蛋白在细胞核中累积并激活靶基因的表达程序，并丧失E-钙粘蛋白，促进上皮-间质细胞进场，促进癌症发生。本研究结果表明β-连环蛋白阴性患者也存在更长的生存时间。

综上，p53、β-连环蛋白与IL-10联合检测对EB病毒相关性胃癌的早期诊断和疾病预后评估存在一定的临床运用价值。

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