人参皂苷Rh2促进人子宫内膜癌细胞凋亡及其机制研究

王 敏

人参是最重要的中药材之一，有多种药理作用，在临床中应用广泛。人参的主要生物学活性依赖于人参皂苷，人参皂苷属于三萜皂苷，具有多种生物学活性，如抗炎、抗氧化、促进血管舒张、对部分肿瘤的抗癌活性等[1-5]。人参皂苷有多种活性成分，包括Rh1、Rh2、Rg1、Rg3和其他成分等。既往研究显示，人参皂苷分子糖基数目越少，其抗肿瘤活性越好[6-7]。人参皂苷Rh2对多种肿瘤细胞均有显著的增殖抑制活性，但是其作用机制尚未明确[7-8]。此外，人参皂苷Rh2对子宫内膜癌的治疗效应及其分子机制尚不清楚。因此，本研究中探讨了人参皂苷Rh2对子宫内膜癌细胞增殖的抑制活性及其诱导细胞凋亡的相关机制。

1 材料与方法

1.1 体外细胞培养 人子宫内膜癌细胞HEC1A，购于ATCC；采用DMEM培养液，补加10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素。细胞培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱内，取对数生长期细胞进行相关实验。

1.2 CCK-8检测细胞抑制率 使用96孔板按3000个/孔接种HEC1A细胞，孵育24 h，待细胞贴壁生长。按照相应设计浓度加入含人参皂苷Rh2的培养基，孵育相应时间后，更换100 μl培养基（含10 μl CCK-8 溶液），孵育 30 min，酶标仪（Immunoskan340型，英国BDSL公司）检测450 nm处光密度D值，并计算细胞增殖抑制率。实验设置5个复孔，并独立重复3次。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 相等数量细胞分别接种于培养皿中，待生长融合至40%～50%时，更换含不同浓度人参皂苷Rh2的DMEM培养基，继续培养24或48 h。收集全部细胞（含悬浮细胞），再重悬为100 μl细胞悬液，加入Annexin V-FITC和PI染液，室温避光反应15 min，补充400 μl PBS后，使用流式细胞仪（FC500Mcl型，美国Beckman Coulter公司）检测凋亡细胞率。

1.4 蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达 收集相应处理的HEC1A细胞，加入PIPA裂解液，置于冰上震荡裂解30 min，12 000 r/min离心30 min，收集蛋白上清。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。使用聚丙烯酰氨凝胶电泳上样缓冲液混匀蛋白样品，沸煮 10 min保存蛋白样本。采用SDS-PAGE、湿转法将蛋白样品转膜硝酸纤维素滤膜，使用5%的脱脂奶粉TBST缓冲液室温下脱色摇床上封闭1 h。加入cleaved PARP和caspase-3单克隆抗体(美国 Cell SignalingTechnology公司)4℃孵育过夜，加入1:2000辣根过氧化酶标记的山羊抗兔抗体(美国Pierce公司)室温孵育1 h。最后，采用电化学发光法(ECL)显影。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析数据，实验数据以±s表示，采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rh2对HEC1A细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示，随人参皂苷Rh2浓度升高，HEC1A细胞增殖的抑制效果显著增强；采用同一浓度人参皂苷Rh2处理时，HEC1A细胞的增殖抑制效应随处理时间延长而增强。提示人参皂苷Rh2可以显著抑制HEC1A细胞增殖，其抑制效果呈现显著的浓度-时间依赖性（表1）。

表1不同浓度人参皂苷Rh2对HEC1A细胞增殖的抑制率（%）

2.2 人参皂苷Rh2诱导HEC1A细胞凋亡 流式细胞术检测结果显示，用20 μM或40 μM人参皂苷Rh2分别处理HEC1A细胞24 h或48 h，结果显示，处理48 h诱导的细胞凋亡率明显升高(P<0.01，图1、2)，提示人参皂苷Rh2诱导HEC1A细胞凋亡呈现时间依赖性。但是，两浓度人参皂苷Rh2处理24或48 h之间比较，HEC1A细胞凋亡率无显著差异（P>0.05）。

2.3 人参皂苷Rh2对凋亡相关蛋白表达的影响

免疫印迹实验结果显示，随着人参皂苷Rh2处理时间延长，激活性的PARP和caspase-3蛋白水平显著升高（图3），提示人参皂苷Rh2通过增强caspase-3和PARP的活化，诱导HEC1A细胞的凋亡。但是，两浓度人参皂苷Rh2处理24或48 h之间比较，caspase-3和PARP蛋白水平无显著差异（P>0.05）。

图3 不同浓度和时间人参皂苷Rh2对HEC-1A细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

图1 流式细胞术检测不同浓度人参皂苷Rh2处理HEC1A细胞的各时间点的细胞凋亡率

3 讨论

本研究结果表明，人参皂苷Rh2可以促进子宫内膜癌细胞凋亡，且呈现出显著的时间依赖性和一定水平的剂量依赖性。其作用机制可能是，人参皂苷Rh2通过增强caspase-3和PARP活化，诱导子宫内膜癌细胞凋亡。

作为人参皂苷主要抗肿瘤活性成分，Rh2对多种肿瘤具有显著的增殖抑制作用。相比有两个糖基的其他人参皂苷成分，仅有一个糖基的Rh2显示出更强的促凋亡活性[6]。既往研究显示，Rh2通过调控细胞自噬、β-catenin信号通路、抑制MMP13，进而抑制多种肿瘤细胞的增殖速度[9-11]。本研究也发现，人参皂苷Rh2抑制子宫内膜癌增殖活性，与其诱导细胞凋亡存在显著相关性。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡。在凋亡相关细胞通路激活后，半胱天冬酶（caspases）裂解活化[12]。凋亡细胞通常呈现为细胞体积缩小、变形[13]，其过程涉及一系列分子的级联反应，包括形态学改变、染色质凝聚和DNA碎裂等[14]。细胞凋亡的异常调控可导致多种疾病，包括恶性肿瘤。因此，靶向细胞凋亡机制是肿瘤治疗的重要策略[15]。

caspase活化受到多种细胞因子的调控。caspase级联反应是细胞凋亡信号转导通路的一个关键步骤，可分为两个亚群：上游起始半胱天冬酶和下游效应半胱天冬酶，直接与终末凋亡过程相关[16]。caspase级联反应的程序性细胞死亡过程中，其核心成分是凋亡蛋白酶激活因子（apaf-1）复合物的形成和Bcl-2家族异二聚体蛋白的形成[17]，调控半胱天冬酶的激活[18]。bcl-2相关蛋白按照功能分为两组：抑制或促进细胞凋亡蛋白。细胞凋亡过程中，细胞色素C的细胞质易位促使apaf-1复合体的形成，激活caspase-9，然后激活其他半胱天冬酶[19]。最终，半胱天冬酶裂解活化发生程序性细胞死亡。多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是半胱天冬酶的底物，在细胞凋亡过程中裂解成为蛋白片段[20]。本研究结果显示，人参皂苷Rh2诱导的子宫内膜癌细胞凋亡，与casepase-3和PARP活化相关，这可能是人参皂苷Rh2抗肿瘤活性的重要机制之一。

总之，人参皂苷Rh2可以显著抑制子宫内膜癌细胞的体外增殖，其作用机制与诱导细胞凋亡相关。人参皂苷Rh2是促进肿瘤细胞凋亡的天然化合物，是一种很有前途的天然抗癌药物，值得进一步临床研究。