抗氧化剂对二氧化硫诱导的大鼠心脏线粒体损伤的缓解作用

夏 瑾,秦国华,2*,桑 楠



抗氧化剂对二氧化硫诱导的大鼠心脏线粒体损伤的缓解作用

夏 瑾1,秦国华1,2*,桑 楠1

(1.山西大学环境与资源学院,山西 太原 030006；2.暨南大学环境学院,广州市环境暴露与健康重点实验室,广东 广州 510632)

采用Wistar大鼠作为模型进行整体动物染毒, SO2组动式吸入SO2(7mg/m3) 28d,每天4h; SO2+NALC (N-乙酰半胱氨酸)组吸入同样条件的SO2,且自SO2染毒之日起隔天腹腔注射50mg/kg b.w. NALC,对照组吸入新鲜空气并注射生理盐水.采用荧光定量PCR技术检测心脏组织中氧化磷酸化复合体亚基CO1和ATP6以及核转录因子PGC1-α、NRF1、TFAM的mRNA转录水平;并采用Western blot技术检测3种线粒体调控基因的蛋白表达.结果发现,在吸入SO2后,核转录因子PGC1-α、NRF1、TFAM的mRNA转录和蛋白表达水平显著降低,并且2种亚基CO1和ATP6的mRNA转录水平也显著下降,而抗氧化剂NALC处理能够明显缓解3种核转录因子及2种复合体亚基表达水平的下降.提示SO2暴露通过下调PGC1-α、NRF1、TFAM表达来影响线粒体DNA的转录,干扰氧化磷酸化重要组分的合成,该过程发生机制可能与自由基的产生相关,而抗氧化剂的使用可有效缓解SO2诱导的心脏线粒体损伤作用.

SO2；抗氧化剂；线粒体；氧化磷酸化

作为一种主要的气态大气污染物, SO2可通过含硫化石燃料的燃烧、汽车尾气的排放等形式进入到环境中[1].SO2能够迅速有效地被生物体上呼吸道吸收,随后转变为亚硫酸盐和亚硫酸氢盐的衍生物,随体液循环运输至外周器官[2].流行病学研究表明,SO2与日益升高的心血管疾病住院率之间存在明确的相关性,在诱发缺血性心脏疾病的过程中具有重要作用[3].动物实验结果表明,吸入SO2以后,心脏组织中亚硫酸盐的含量显著升高[4].实验室前期研究表明,SO2可诱导小鼠心脏和肺部发生氧化损伤[5].线粒体是暴露于SO2的小鼠心肌细胞中最敏感的细胞器[6].线粒体是氧化磷酸化的主要场所,而亚硫酸盐的毒性与线粒体氧化磷酸化功能受损有关[7].研究证实,吸入SO2后可在小鼠心肌层观察到线粒体肿胀、嵴的减少和消失、心肌肌原纤维的紊乱[6].维持心脏的收缩需要较高且稳定的ATP水平,而线粒体功能障碍则会对心肌产生极端不利的影响,有研究证明线粒体功能损伤与心衰相关[8].越来越多的研究表明线粒体功能障碍与心血管疾病密切相关.本课题组研究发现, SO2吸入会导致大鼠心脏氧化磷酸化复合体——细胞色素C氧化酶(复合体IV)和ATP合酶(复合体V)亚基的mRNA转录水平发生改变[9].氧化磷酸化负责产生行使正常的细胞功能时所需的大部分ATP,氧化磷酸化过程受多种因子和生物过程如激素水平、供氧、转录因子等的调控,一些转录因子如转录辅激活物过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅助活化因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子1 (NRF1)、线粒体转录因子A(TFAM)在细胞核-线粒体信息通讯过程中发挥重要作用[10-11].而SO2吸入会通过降低这些与线粒体氧化磷酸化相关的转录因子的表达来影响线粒体DNA的复制及转录,进而导致线粒体功能受损[9].

本研究通过测定大鼠心脏线粒体氧化磷酸化调控基因PGC1-α、NRF1和TFAM的mRNA转录水平和蛋白表达水平以及氧化磷酸化复合体的2种亚基CO1和ATP6的mRNA转录水平,来检测抗氧化剂对SO2诱导的大鼠心脏线粒体损伤的改善效应.

1 材料与方法

1.1 主要试剂

NALC(N-乙酰半胱氨酸)购自Sigma公司;提取总RNA时所用Trizol、反转试剂盒以及荧光定量PCR试剂均购自于Takara公司;引物合成由上海英潍捷基生物有限公司完成; anti-GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology; anti-PGC1-α、anti- NRF1、anti-TFAM抗体均购自于Bioss公司;其余试剂均为国产分析纯.

1.2 整体动物染毒实验

体重200g左右的SPF级Wistar成年雄性大鼠21只,购自河北实验动物中心,随机分为3组,每组7只,分别为对照组、SO2组、SO2+NALC组. 12h昼夜周期,外界温度为(24±2)℃,湿度为50%±5%,其中SO2组和SO2+NALC组暴露于7mg/m3的SO2中进行动式吸入染毒,对照组接受过滤后的洁净空气.每天染毒4h,持续染毒28d. SO2自动监测仪实时监测箱体内SO2浓度,染毒期间禁水禁食,其余时间自由进水进食. SO2+NA LC组自染毒之日起以腹腔注射的方式隔天注射50mg/kg (b.w.) NALC,对照组和SO2组注射生理盐水.染毒结束后处死大鼠,组织放入液氮中速冻随后转入-80℃储存.

1.3 总RNA的提取与荧光定量PCR

取50~100mg大鼠心脏组织,用Trizol提取总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,确保OD260/280值处于1.8~2.0范围内,取1μg总RNA,使用反转试剂盒合成cDNA,将产物放置于-80 ℃备用. IQ5Real-Time PCR系统(Bio-Rad,USA)进行扩增,荧光定量PCR所用的引物序列见表1. PCR反应体积为20μL,其中含有1μL cDNA,10μL SYBR Premix Ex Taq,上下游引物各1μL, H2O 7μL.反应条件为:95℃ 3min, 95℃ 20s, 55℃ 20s, 72℃ 20s,所有PCR扩增片段的大小均已经溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳证实.

表1 荧光定量PCR所用引物序列

1.4 总蛋白的提取与Western blot

取大鼠心脏组织50~80mg,加入1mL裂解缓冲液,成分为:1%乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40), 1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 125mmol/L氟化钠(sodium fluoride), 0.5mmol/L钒酸钠(sodium vanadate), 2.5μg/mL抑肽酶(aprotinin), 5μg/mL胃蛋白酶抑制剂(pepstatin), 50μg/mL亮抑酶酞(leupeptin), 25μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF), 25μg/mL胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor).匀浆至无组织块后, 4℃, 13000r/min离心15min,取上清.以BSA作为标准蛋白,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度, -80℃备用.Western blot检测目的蛋白表达水平: 50μg蛋白上样量,加蛋白上样缓冲液,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,将蛋白电转至硝酸纤维素膜上,封闭,加对应的一抗与目的蛋白特异性结合,4℃孵育过夜,清洗一抗,加荧光二抗与一抗结合,清洗二抗, LI-COR Odyssey红外荧光系统扫描检测,结果表示为目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度比值.

1.5 数据统计学处理

用SPSS 17.0对数据进行统计分析.数据以均值±标准误(mean±SE)的形式表示,用two-way ANOVA及事后LSD检验统计SO2组与对照组、SO2组与SO2+NALC组之间的差异显著性.<0.05认为具有统计学上的显著性差异.

2 结果

2.1 SO2暴露对大鼠心脏组织中CO1和ATP6mRNA转录水平的影响

图1 SO2暴露对大鼠心脏组织中CO1和ATP6mRNA转录水平的影响

与对照组相比:*<0.05,**<0.01;与SO2组相比:#<0.01,##<0.001

由图1可知, SO2吸入后,大鼠心脏组织中ATP6和CO1的mRNA转录水平分别为对照组的0.59倍和0.72倍,与对照组相比显著下降,而SO2+NALC组ATP6和CO1的mRNA转录水平均恢复至对照组的1.19倍,表明NALC能够显著恢复ATP6和CO1的mRNA转录水平.

2.2 SO2暴露对大鼠心脏组织中PGC1-α、NRF1和TFAM mRNA转录水平的影响

由图2可知, SO2吸入后大鼠心脏组织中PGC1-α、NRF1和TFAM mRNA转录水平分别为对照组的0.68倍、0.71倍和0.74倍,显著低于对照组水平,而SO2+NALC组PGC1-α、NRF1和TFAM的mRNA转录水平分别恢复至对照组的0.98倍、1.01倍和0.99倍,表明NALC能够显著且有效地恢复PGC1-α、NRF1和TFAM的mRNA转录至对照组水平.

图2 SO2暴露对大鼠心脏组织中PGC1-α、NRF1和TFAM mRNA转录水平的影响

与对照组相比:*<0.05;与SO2组相比:#<0.05,##<0.01

2.3 SO2暴露对大鼠心脏组织中PGC1-α、NRF1和TFAM蛋白表达水平的影响

与对照组相比:*<0.01,**<0.001;与SO2组相比:#<0.05,###<0.001

由图3可知, SO2吸入后,大鼠心脏组织中PGC1-α、NRF1和TFAM蛋白表达水平分别为对照组的0.53倍、0.36倍和0.68倍,与对照组相比下降极其显著,而SO2+NALC组PGC1-α、NRF1和TFAM的蛋白表达水平分别恢复至对照组的0.71倍、0.79倍和0.70倍,分别升高了34%、119%和2.9%,表明NALC能够非常显著地恢复PGC1-α和NRF1的蛋白表达水平,并一定程度上提高了TFAM的蛋白表达水平.

2.4 双因素无重复实验方差分析

如表2所示,SO2处理显著影响各目的基因的mRNA转录和蛋白表达水平,NALC处理除了对TFAM的蛋白表达水平的影响无统计学差异,对其他目的基因的mRNA转录和蛋白表达水平均影响显著.

3 讨论

近年来,流行病学研究发现,空气污染物如SO2、PM2.5等与心血管疾病发病率和死亡率的升高密切相关[12].其中SO2作为一种全身性毒物[13-15],其对亚细胞结构的损伤已经受到广泛的关注.实验室前期研究表明,SO2可引起小鼠几种组织器官(包括心脏)超微结构发生不同程度的改变,在不同的亚细胞结构中,线粒体受损伤最为严重[6].线粒体是真核细胞产生能量的主要场所,其代谢产生的能量是机体内能量的主要来源.心脏作为机体消耗能量最大的器官,心肌细胞活动对线粒体高度依赖,与其他肌细胞相比,心肌细胞所含线粒体更为丰富.线粒体大约构成了心肌细胞总胞浆量的1/3,主要依靠线粒体氧化磷酸化来获取能量.线粒体氧化磷酸化主要成分受核DNA (nDNA)和线粒体DNA (mtDNA)的双重控制. TFAM是一个由核基因编码的蛋白,可调节线粒体DNA的复制和转录[16-17],而NRF1能活化TFAM的表达[10,18]. PGC1-α作为一个重要的辅激活因子,能诱导NRF1表达,与NRF1结合后共同作用于TFAM的启动子区,调节线粒体基因组的转录与复制[19].细胞色素C氧化酶由13个亚基组成,其中最大的3个亚基CO1、CO2、CO3是由mtDNA编码[20]. ATP合酶由12个多肽组成,其中ATP6和ATP8由mtDNA编码[21].与细胞的nDNA相比,mtDNA是母系遗传,没有组蛋白保护,呈裸露状态,又缺乏有效的修复系统,而且为不对称复制,复制频率和次数高,因此mtDNA更易受损伤.而CO1和ATP6作为mtDNA编码的与线粒体能量代谢相关基因也更易受到SO2影响.

表2 双因素无重复实验方差分析

注:双因素方差分析F值如表所示,分子自由度均为1,荧光定量PCR结果的分母自由度为18,蛋白免疫印记结果的分母自由度为6;*<0.05,**<0.01, ***<0.01.

本研究选取7mg/m3作为SO2整体动物染毒浓度,出于以下两点考虑:首先,美国国家职业安全卫生研究所推荐的职业工作环境中SO2浓度为0.5~ 20.0mg/m3[22].其次,在本研究中动物每天暴露于SO2的时间为4h,但实际情况下人或动物则是每天24h暴露于污染的大气中.因此,本研究使用的7mg/m3高于人类嗅觉阈值,与职业工作环境的浓度相一致[23].

在本研究中,吸入SO2后显著降低了大鼠心脏组织中3种调控基因PGC1-α、NRF1和TFAM的转录和翻译水平,并且由mtDNA编码的CO1和ATP6的mRNA水平也发生了显著下降,实验室前期研究表明吸入SO2可显著降低大鼠心脏组织线粒体中的ATP含量[24].上述结果提示SO2可能通过下调PGC1-α、NRF1和TFAM 3种核转录因子,影响线粒体DNA的复制和转录,下调线粒体DNA编码的呼吸链复合体亚基的表达水平,干扰线粒体的生物合成,影响氧化磷酸化.由于维持心脏收缩功能需要较高水平的ATP,因此一旦发生线粒体功能障碍将会对心肌细胞产生极其不利的影响.研究表明发生充血性心力衰竭的心肌细胞中线粒体基因转录水平低,PGC1-α、NRF1和TFAM表达水平下调[10].因此推测SO2所引起的人群中缺血性心脏病、心力衰竭等心血管疾病的发生可能是通过线粒体电子传递链上重要组分来影响线粒体的呼吸作用及能量代谢,继而对心脏功能产生不利影响.

已有研究表明, SO2急性暴露导致小鼠心脏组织中氧化应激水平升高[5],并且在受到亚硫酸盐刺激的人中性粒细胞中能够检测到•SO3–, •SO4–, •OOH, •OH自由基的存在[25].最近有研究显示,无论过氧化氢存在与否,线粒体亚血红素蛋白细胞色素C均能够将亚硫酸盐氧化为亚硫酸盐自由基[26].而亚硫酸盐自由基是一种强效氧化剂,能够氧化或破坏任何一种生物分子,所以亚硫酸盐自由基可能与SO2导致的线粒体损伤有关.因此,在本研究中加入了抗氧化剂NALC,同时也是一种自由基清除剂.有报道指出,腹腔注射50mg/kg b.w. NALC时能有效抑制四氯化碳及硫代乙酰胺诱导的大鼠肝脏纤维化及肝损伤[27],所以在本研究中采用了相同的NALC剂量.结果表明, NALC处理可显著提高PGC1-α、NRF1和TFAM 3种调控基因的mRNA转录和蛋白表达水平,同时显著增加了2种氧化磷酸化复合体亚基CO1和ATP6的mRNA转录水平.前期研究发现, NALC处理可显著降低SO2对心肌细胞内ROS所产生的诱导作用[28].这一结果提示SO2对线粒体产生损伤可能是通过诱导自由基的产生,影响PGC1-α、NRF1和TFAM等的转录,进而抑制线粒体电子传递链重要组分的合成,而NALC能够通过清除ROS来有效抑制这种现象.

线粒体是产生ROS的主要细胞器,低氧水平(比如缺血)会降低呼吸链的效率,导致ROS的产生[29].研究表明,呼吸链产生的ROS参与了体细胞mtDNA损伤的过程[30].其他研究发现, As2O3能够诱导ROS产生导致小鼠卵母细胞mtDNA损伤[31].在本研究中,吸入SO2导致mtDNA编码的氧化磷酸化复合体亚基CO1和ATP6的mRNA转录水平明显降低,而SO2+NALC处理组mtDNA编码亚基的mRNA水平显著升高,提示吸入SO2引起的mtDNA损伤可通过抑制ROS产生来得到有效缓解.研究发现一些细胞因子诸如TNF-α和TGF-β能够降低PGC1-α及其下游靶基因的mRNA表达水平[32-33],但越来越多的证据表明MAPK、ERK1/2信号通路在PGC1-α调节线粒体功能过程中发挥重要作用[34,35],然而具体机制仍需进一步研究证实.

4 结论

4.1 吸入SO2引起大鼠心脏组织PGC1-α、NRF1和TFAM 3种调控基因的转录和翻译水平显著降低.

4.2 吸入SO2引起大鼠心脏组织氧化磷酸化复合体亚基CO1和ATP6的mRNA转录水平显著降低.

4.3 抗氧化剂NALC能够显著缓解SO2引起的线粒体能量代谢相关基因表达水平的下降,提示该过程可能与自由基的产生相关.

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Antioxidants alleviated sulfur dioxide-induced mitochondrial damage in rat hearts.

XIA Jin1, QIN Guo-hua1,2*, SANG Nan1

(1.College of Environmental Science and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Guangzhou Key Laboratory of Environmental Exposure and Health, School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China)., 2018,38(8)：3129~3134

Male Wistar rats were exposed to SO2(7mg /m3) for 28 days, 4 hours per day in SO2group. Rats in SO2+NALC group were exposed to SO2and NALC (50mg/kg b.w., i.p.) every other day, which was dissolved in saline. Rats in control group were exposed to filtered air and saline. The mRNA levels of complexes IV and V subunits (CO1&ATP6) and three mitochondrial transcript factors (PGC1-α, NRF1, TFAM) were analyzed by real-time RT-PCR after exposure. And the protein levels of the above three mitochondrial transcript factors were detected by Western blot. The results showed thatthe mRNA and protein expression levels of PGC1-α, NRF1and TFAM were decreased significantly after SO2inhalation, combined with the down-regulations of CO1&ATP6 on mRNA levels. But NALC could alleviate the depressions of these genes. It indicated that SO2exposure could impact the transcription of mitochondria DNA through PGC1-α-NRF1-TFAM down-regulation, interfere the synthesis of important components of oxidative phosphorylation. The mechanism might be related to the production of free radicals. Antioxidants could be used to alleviate sulfur dioxide-induced mitochondrial damage in rat hearts.

SO2；antioxidants；mitochondria；oxidative phosphorylation

X503.22

A

1000-6923(2018)08-3129-06

夏 瑾(1993-),女,河南民权人,山西大学硕士研究生,研究方向为环境毒理学.

2018-01-06

国家自然科学基金资助项目(21777091);广州市环境暴露与健康重点实验室开放基金资助项目(GZKLEEH201612);环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金资助项目(KF2016-17)

* 责任作者, 教授, qinguojua@sxu.edu.cn