辽东湾潜在褐潮生物时空分布及环境关联

宋 伦,吴 景,李 楠,杜 静,杨 爽,王 鹏



辽东湾潜在褐潮生物时空分布及环境关联

宋 伦1,2,吴 景2,李 楠2,杜 静2,杨 爽2,王 鹏1*

(1.哈尔滨工业大学环境学院,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090；2.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁 大连 116023)

以18S rDNA V4区作为目标基因,利用自行设计的真核浮游植物鉴定引物V4(F/R),结合高通量测序技术,对辽东湾2014年四季海水中真核浮游植物多样性进行了检测.结果发现了8种潜在褐潮生物:抑食金球藻、金牛微球藻、微拟球藻、颗粒微拟球藻、细小微胞藻、密球藻、普通小球藻、钙质角毛藻,其中前2种生态风险较高,主要分布在辽东湾西南、东南两侧.除抑食金球藻和细小微胞藻为混合营养型外,其他6种均为自养型.细小微胞藻丰度最高(平均161445个/L),主要分布在秋季;其次是抑食金球藻、金牛微球藻(平均13912,13717个/L),主要分布在春季;之后为钙质角毛藻、普通小球藻(平均5498,5234个/L),主要分布在秋季;密球藻(平均1345个/L),主要分布在夏季;微拟球藻、颗粒微拟球藻最少(平均56,44个/L),冬季无分布.辽东湾潜在褐潮生物丰度与水温、水深、无机氮、N/P显著相关,其群落结构演替与环境因子关联性有待于进一步研究.

褐潮生物；生态分布；环境关联；辽东湾

辽东湾是渤海最大的半封闭式海湾,是海洋生物重要的索饵场、产卵场、越冬场和洄游通道,但多年来超负荷承载陆源污染,近岸海域富营养化严重,赤潮、褐潮频发[1-2].辽东湾西南侧海域从2009年开始至今每年都暴发抑食金球藻()褐潮,最大面积达3400km2,褐潮期间养殖贝类滞长、部分死亡,生态系统遭到破坏,旅游业、水产养殖业经济损失巨大[3-4].微微型浮游植物(0.22~3μm)在海洋中多样性相当丰富,也是褐潮暴发的主要致灾种,由于个体微小、形态学鉴定困难一度研究较为迟缓[5].分子鉴定虽然存在一些问题,但比传统形态学镜检方法鉴定更为高效,尤其可提高微微型浮游植物的检出率,随着高通量测序技术的发展极大地推动了微型藻类的高效检测研究[6-7],分子鉴定技术也逐渐被国内外学者所接受,采用该技术,2014~2015年宋伦等在辽东湾长兴岛海域又发现了尚未报道的微拟球藻(sp.)和金牛微球藻()褐潮致灾种[8].同时发现了褐潮致灾种抑食金球藻在辽东湾的扩散迹象[9].

目前辽东湾的浮游植物传统检测只记录了95种[10],尚未记录微微型种类,作为褐潮风险研究背景数据极其匮乏.鉴于此,本研究采用高通量测序平台,结合生物信息学方法,以18S rDNA的V4区为目标基因,筛查了辽东湾海域的真核微微型浮游植物种类,分析了其与环境因子的相关性,旨在为褐潮风险预警研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集及制备

2014年在辽东湾海域网格化设置12个站位(图1),分别于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采集表层海水1L.样品首先经200μm筛绢过滤去除大型浮游生物,然后用0.22μm微孔滤膜收集真核浮游植物(其中1、3、10站位分别增加1L样品依次经20,3,0.22μm微孔滤膜过滤,以辅助判定各藻类粒径大小),最后将滤膜转移至1.5mL无菌离心管中,置于-20或-80℃冷冻保存、运输.站位选取主要依据《海洋调查规范》(GB/T 12763-2007),主要考虑样品的区域代表性和均匀性.

图1 辽东湾采样站位示意

同期进行海水的水温(SST)、水深(Dep)、叶绿素a(Chl a.)、无机氮(DIN)[铵盐(NH4+)、硝酸盐(NO3-)、亚硝酸盐(NO2-)之和]、活性磷酸盐(SRP)、石油类(Oil)、溶解氧(DO)、化学耗氧量(COD)、重金属汞(Hg)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)、镉(Cd)、砷(As)等指标的监测.调查和监测分析方法均参照《海洋调查规范》(GB/T 12763-2007)和《海洋监测规范》(GB17378- 2007)[11-12]执行.

1.1.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法提取微微型浮游植物宏基因组,将滤膜剪碎置于1.5mL离心管中,加入500μL CTAB裂解液(2% CTAB; 100mmol/L Tris-Cl,pH值为8.0;1.4mmol/L NaCl; 10mmol/L EDTA)和1μL β-巯基乙醇,5~10μL蛋白酶K,55℃裂解1~1.5h;12000r/min离心5min,取出液体置于新的离心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清液,加入2倍体积预冷的无水乙醇,沉淀2~3h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到浮游生物基因组DNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度,合格后置于-20℃冰箱保存备用.

1.1.2 18S rDNA可变区V4的PCR扩增 该研究应用的引物为自行开发的真核浮游植物18S rDNA的V4区基因扩增引物——V4(F/R).上游引物为V4-F序列5'-GCGGTAATTCCAGCT CCAATA-3',下游引物为V4-R序列5'-GATCCCCHWACTTT- CGTTCTTGA-3'[8].将引物连接适当的接头送往上海生工生物公司进行合成. PCR反应体系为50μL,包括PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板DNA 2μL、Taq DNA聚合酶2.5U,加适量灭菌水.扩增反应均在PE 9700型PCR仪(美国PE公司)上完成,反应条件:94℃预变性3min;94℃变性 30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,共33个循环;72℃延伸5min. 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,将检测合格的产物交由诺和致源生物信息科技有限公司,使用NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量(Thermo Scientific)和文库检测,合格后,使用Hiseq2500PE250模式进行上机测序.

1.2 数据分析

测序得到的原始数据使用FLASH软件进行拼接,参照Qiime软件质量控制流程将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据.利用Uparse (http://drive5.com/uparse/)对有效数据进行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类,采用RDP Classifier方法与SILVA数据库(https://www. arb-silva.de/,Version 108)对OTUs代表序列进行物种注释[13].研究表明,粒径相同的微藻序列数比例更接近于丰度比例[14],镜检同期水样中出现的所有浮游植物,筛选各站位出现频度最高、粒径最小的角毛藻(sp.)作为密度基准种类[15],通过序列数比测算潜在褐潮藻类密度,相关公式:

式中:D为某站位潜在褐潮生物密度,ind/L;N为同一站位水样中所有角毛藻密度,由镜检获得, ind/L;N为某站位水样中所有角毛藻的序列数;D为某站位褐潮生物的序列数.

采用相对密度(RA)计算潜在褐潮生物密度在各季节的比例:

式中:n为潜在褐潮生物在站的密度,ind/L;为统计单元的总密度,ind/L.

公式计算、数据分析、方差检验、等值线绘制均通过Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0、PRIMER 5.0软件完成.

2 结果

2.1 测序数据质量

通过IlluminaHiSeq 2500测序平台进行PE250模式测序,所得原始数据使用FLASH软件进行拼接,参照Qiime软件质量控制流程,将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据.每个样品平均获得77297条原始序列,经过拼接和质量过滤,每个样品平均得到70604 条序列,高质量数据占到91%以上,表明测得的数据准确可靠.各样品测序结果见表1.

表1 有效序列数及OTUs数统计

2.2 OTUs聚类和物种注释

为进一步分析表层海水样品中物种组成多样性信息,使用Uparse软件对所有样品的有效序列进行聚类分析,以97%的一致性将序列聚类成为OTUs种水平,每个样品平均获得378个OTUs,剔除原生动物OTUs数后,春、夏、秋、冬注释到种的浮游植物种类分别为150、187、183、195.

2.3 潜在褐潮生物筛查

一般将小于3μm藻类引发的赤潮定义为褐潮.根据相关文献统计[16],并分析1、3、10站位通过3μm截留在0.22μm微孔滤膜上的浮游植物优势组份,发现辽东湾注释到种、小于3μm的潜在的褐潮生物共有8种:抑食金球藻(主要分布在辽东湾南部的7、8、11号站)、微拟球藻() (主要分布在辽东湾南部和中东部的4、5、8、9、10号站,冬季未检出)、颗粒微拟球藻() (主要分布在辽东湾南部的4、8、12号站,冬季未检出)、金牛微球藻(主要分布在辽东湾西、东部的觉华岛和营口海域1、2、9、10、12号站,秋、冬季未检出)、细小微胞藻() (主要分布在辽东湾中西、中东及东南部的2、9、12号站)、密球藻() (主要分布在辽东湾南部的8、11号站)、普通小球藻() (主要分布在辽东湾中、东部的5、10号站)、钙质角毛藻() (主要分布在辽东湾西、中部的1、3、5、7号站),其在辽东湾生态分布及特征见表2.

表2 辽东湾潜在褐潮生物种类及生态特征

注:“-”没有检出. Mixo:mixotrophy混合营养;Auto: autotrophy自养.

2.4 潜在褐潮生物种属确定

高通量测序获得8种褐潮生物部分18S rDNA序列片段长度为380bp左右,通过NCBI Blast比对,抑食金球藻在18S rDNA(KT585674.1)基因序列中对应的位置为563~942bp,金牛微球藻在18S rDNA(KT860912.1)基因序列中对应的位置为489~ 849bp,细小微胞藻在18S rDNA(KT888608.1)基因序列中对应的位置为489~858bp,普通小球藻在18S rDNA (KU720636.1)基因序列中对应的位置为492~865bp,密球藻在18S rDNA(JQ315741.1)基因序列中对应的位置为495~869bp,钙质角毛藻在18S rDNA(KT585674.1)基因序列中对应的位置为582~ 956bp,此部分序列相似度为99%~100%,拟合度期望值(E-value)均为0.

采用邻接法选择棕鞭藻门、金藻门、绿藻门、硅藻门中部分藻类的18S rDNA序列构建系统进化树.建树结果显示,高通量测序获得的8种潜在褐潮生物18S rDNA V4区序列与基因库中相应藻类聚在一个分支,其支持率为100%,进而确定对应种属.

2.5 潜在褐潮生物季节分布

潜在褐潮生物中细小微胞藻密度最高(四季平均161445个/L),其次是抑食金球藻、金牛微球藻(四季平均13912,13717个/L),之后为钙质角毛藻、普通小球藻(四季平均5498,5234个/L),密球藻(四季平均1345个/L),微拟球藻、颗粒微拟球藻最少(四季平均56,44个/L).

统计各褐潮生物季节相对密度发现,春季抑食金球藻、颗粒微拟球藻、金牛微球藻密度占比最高,均超过50%;夏季密球藻密度占比最高(80%);秋季钙质角毛藻、普通小球藻、微拟球藻、细小微胞藻密度占比最高,均超过50%;冬季占比最少(图2).

图2 潜在褐潮生物季节相对密度分布

2.6 潜在褐潮生物生态分布

除抑食金球藻和细小微胞藻为混合营养外,其他6种均为自养型.抑食金球藻在辽东湾春季密度最高,夏、秋、冬季密度逐渐下降(相对密度61.4%,19.3%,13.1%,6.2%),说明春季为抑食金球藻的主要繁殖季节,其在辽东湾的生态分布见文献[9].

2.6.1 金牛微球藻 该藻在辽东湾春、夏季分布较广,秋、冬季所有站位均未检出,季节性分布较明显.春季检出金牛微球藻密度最高,分布在0.010×103~ 25.745×103个/L之间,平均值为7.041×103个/L,最高值出现在2号站位,最低值出现在8号站位,高值区主要分布在辽东湾的东、西近岸(2、4、6、9、10、11、12号站位密度均超过103个/L,其中2、9、10号站位密度均超过104个/L),辽东湾中南部海域密度相对较小;夏季密度分布在0.0003×103~22.662× 103个/L之间,平均值为6.676×103个/L,最高值出现在1号站位,最低值出现在5号站位,高值区主要分布在辽东湾的东南、西南两侧海域(1、2、3、4、6、9、10、11、12号站位密度均超过103个/L,其中1、2、12号站位密度均超过104个/L),辽东湾中部海域密度相对较小.各站位金牛微球藻密度的季节分布见图3.

等值线表示金牛微球藻密度,ind/L

2.6.2 微拟球藻 该藻在辽东湾分布较少,春季只在9号站位的营口鲅鱼圈近岸海域有检出,密度为129.56个/L,其他站位均未检出;夏季在4、9、10号站位的绥中、大连长兴岛、营口鲅鱼圈近岸海域有检出,密度分别为65.51,2.77,3.80个/L;秋季在5、8号站位的辽东湾北、南中部海域有检出,密度分别为470.44,0.62个/L,冬季所有站位没有检出.微拟球藻密度的季节分布见图4.

2.6.3 颗粒微拟球藻 该藻辽东湾分布也较少,春季只在3、12号站位的葫芦岛兴城、大连旅顺近岸海域有检出,密度分别为0.41,345.95个/L,其他站位均未检出;夏季在8、9、11、12号站位的辽东湾东南、东北近岸海域有检出,密度分别为4.68,2.77, 4.89,115.62个/L;秋季在2、4号站位的辽东湾西部海域有检出,密度分别为12.32,40.07个/L,冬季所有站位没有检出.各站位颗粒微拟球藻密度的季节分布见图5.

等值线表示微拟球藻密度,ind/L

2.6.4 细小微胞藻 该藻在辽东湾分布较广,四季所有站位均有检出,优势度明显.春季检出密度分布在0.047×103~304.596×103个/L之间,平均值为51.419×103个/L,最高值出现在9号站位,最低值出现在8号站位,高值区主要分布在辽东湾的东部(除了3、7、8号站位,其余站位密度均超过103个/L,其中2、6、9、10、11、12号站位密度均超过104个/L),辽东湾中南部密度相对较小.

等值线表示颗粒微拟球藻密度,ind/L

夏季密度分布在0.001×103~134.915×103个/L之间,平均值为23.806×103个/L,最高值出现在1号站位,最低值出现在5号站位,高值区主要分布在辽东湾的东、西两侧海域(除了5、7号站位,其余站位密度均超过103个/L,其中1、2、4、9、12号站位密度均超过104个/L),辽东湾中部海域密度相对较小.

冬季密度分布在0.005×103~58.514×103个/L之间,平均值为5.672×103个/L,最高值出现在1号站位,最低值出现在10号站位,高值区主要分布在辽东湾北部海域(1、2、9站位密度均超过103个/L,其中1号站位密度均超过104个/L),辽东湾南部海域密度相对较小.各站位细小微胞藻密度的季节分布见图6.

2.6.5 普通小球藻 该藻在辽东湾分布较广,四季均有分布,少数站位未检出.春季检出密度分布在0~4.950×103个/L之间,平均值为448.880个/L,最高值出现在辽东湾中东部的10号站位,6、7、12号站位未检出,除了10号站位,其他站位密度均未超过200个/L.

夏季密度分布在0~5.824×103个/L之间,平均值为701.640个/L,最高值出现在1号站位,7号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的东南部海域(1号站位密度超过104个/L,3、12号站位密度超过500个/L),辽东湾中部海域密度相对较低.

秋季密度分布在0~47.515×103个/L之间,平均值为3.963×103个/L,最高值出现在辽东湾北部的5号站位,2、4、6、7、9号站位未检出,除了5号站位,其他站位密度均未超过20个/L.

冬季密度分布在0.205~911.818个/L之间,平均值为120.685个/L,最高值出现在辽东湾西北部的1号站位,最低值出现在辽东湾东南部的11号站位,除了1、5、9号站位,其他站位密度均未超过70个/L.各站位普通小球藻密度的季节分布见图7.

2.6.6 密球藻 该藻在辽东湾分布较广,四季均有分布,少数站位未检出.春季检出密度分布在0~395.371个/L之间,平均值为80.582个/L,最高值出现在12号站位,1、6、9号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的东南部海域(10、11、12号站位,但密度均未超过103个/L),辽东湾中西部海域密度相对较小.

夏季密度分布在0~10.637×103个/L之间,平均值为1.070×103个/L,最高值出现在12号站位,4号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的东南部海域(11号站位密度超过103个/L,12号站位密度超过104个/L),辽东湾中西部海域密度相对较小.

但令人遗憾的是，时至今日福建很多地方对武术精神文化或武术人文价值的宣传仅依靠单一的传统媒体。譬如：调研发现在福鼎市和南安市的乡镇以下武术宣传仍以人际传播为主，传播方式依然是千百年来民间自然延续的口口相传，基本没有专业人士介入引导和书面整理；市(县)一级则采用报刊、广播、电视等传统媒体进行宣传，缺少“互联网+”的新媒体参与。长期以来，在一度“唯GDP论英雄”的时代背景下，当地政府对武术的社会经济价值及其对经济发展的直接贡献已经有了明确认知；但更深层次的认知，即对武术的文化内涵与潜在价值的理解仍显轻率，其外在表现是重视力度不够，不能创新和扩大宣传平台(大型国际性赛事除外)。

图6 细小微胞藻密度的季节分布

等值线表示细小微胞藻密度,ind/L

图7 普通小球藻密度的季节分布

等值线表示普通小球藻密度,ind/L

图8 密球藻密度的季节分布

等值线表示密球藻密度,ind/L

图9 钙质角毛藻密度的季节分布

等值线表示钙质角毛藻密度,ind/L

秋季密度分布在0~1.882×103个/L之间,平均值为168.192个/L,最高值出现在辽东湾北部的5号站位,1、2号站位未检出,除了5号站位,其他站位密度均未超过100个/L.

冬季密度分布在0.029~220.094个/L之间,平均值为25.497个/L,最高值出现在辽东湾西北部的1号站位,最低值出现在辽东湾中东部的10号站位,除了1号站位,其他站位密度均未超过30个/L.各站位密球藻密度的季节分布见图8.

2.6.7 钙质角毛藻 该藻在辽东湾分布较广,四季均有分布,少数站位未检出.春季检出密度分布在0.308~2.807×103个/L之间,平均值为403.910个/L,最高值出现在辽东湾东北部的9号站位,8号站位最低,除了6、9号站位,其他站位密度均未超过500个/L.

夏季密度分布在0.438~791.143个/L之间,平均值为274.759个/L,最高值出现在6号站位,5号站位最低,高值区主要分布在辽东湾的西部海域,辽东湾中南部海域密度相对较低.

秋季密度分布在0~57.394×103个/L之间,平均值为4.806×103个/L,最高值出现在辽东湾北部的5号站位,12号站位未检出,除了5号站位,其他站位密度均未超过100个/L,呈团块集中分布.

冬季密度分布在0.015~94.326个/L之间,平均值为12.904个/L,最高值出现在辽东湾西北部的1号站位,最低值出现在辽东湾东南部的11号站位,除了1号站位,其他站位密度均未超过20个/L.各站位钙质角毛藻密度的季节分布见图9.

2.7 潜在褐潮生物环境关联

应用冗余分析(RDA)方法研究和探讨褐潮生物种群与环境因素的内在关联.2014年5、8、10、12月辽东湾褐潮生物群落与14个环境因子的RDA排序见图10.每个环境因子作为单独的解释变量做RDA排序图,可能由于注释的褐潮生物种类较少,用14个环境因子做RDA排序图时,蒙特卡洛(Monte Carlo)置换检验发现第一轴和所有轴均未呈现显著性差异,根据环境因子的独立解释效应筛选对褐潮生物群落具有显著性影响的环境因子也较少,仅有8月的DIN、10月的Dep和N/P,12月的SST.

A: 14个环境因子的RDA排序; B: 环境变量交互作用预选择RDA排序

3 讨论

3.1 分子鉴定的准确性

不可否认,本次检测获得的藻类DNA信息大部分未能注释到种,主要原因可能是由于某些种类很难培养,基因序列无法获得,造成18s rDNA数据库浮游植物种类不全,注释到种的成功率较低所致.关于分子鉴定的准确性尚有部分学者存有疑虑,主要影响因素有扩增区域的选择、引物的选择或组合、PCR的偏好性、扩增效率的差异、读长的清晰度或解析度和数据库的完善度等[17].但相比传统形态学镜检方式,对物种多样性的发掘已经提升了一个数量级,尤其对微型、微微型浮游植物的发现提供了科学手段,同时大大降低了形态学鉴定的人为主观误差.

3.2 褐潮生物粒级确定

目前认为,粒径小于3μm的微微型浮游植物可被认定为潜在褐潮生物,因此理论上通过3μm截留在0.22μm微孔滤膜上的浮游植物都应归为潜在褐潮生物.但本研究发现,大部分微微型浮游植物被截留在20μm和3 μm微孔滤膜上,而部分小型、微型浮游植物的DNA信息也会在0.22μm微孔滤膜上检测到,产生这一原因很多,首先,由于一些小粒径浮游植物链状群聚,很容易被截留在大孔径滤膜上,随着过滤时间增加,滤膜孔径也会逐渐变小,对小粒径浮游植物截留效率也会越来越高;另外,一些大粒径的浮游植物由于最初过滤压力较大,细胞破碎,DNA被通过截留到小孔径滤膜上;再者,由于浮游植物细胞形状多样,长轴无法通过滤膜的细胞偶而可以短轴形式通过,有研究发现,微型浮游植物在20μm微孔滤膜上的截留率超过85%[18-19].因此本研究将所有粒径浮游植物收集到0.22μm微孔滤膜上(同时方便密度测算),然后进行分子检测,将能注释到种的浮游植物通过文献检索确定粒径大小,没有文献支持的再利用分级滤膜注释信息分析.

3.3 褐潮生物潜在生态风险

本研究发现的8种潜在褐潮生物,有2种已报道褐潮暴发记录(抑食金球藻、金牛微球藻),并且这2种褐潮生物均会影响贝类摄食,其他6种尚未发现对海洋生物的毒害作用,但一旦发生褐潮,其衰败期会造成水体耗氧,也需重视.

抑食金球藻可产生一种抑制双壳类动物摄食的胞外多糖,通过刺激贝类鳃部肌肉收缩、干涉横沟和腹沟的纤毛运动来阻止其摄食.抑食金球藻最适生长温度为20℃左右,渤海褐潮主要发生在温度达到15~20℃的5~6月,超过25℃的7~8月开始衰退,然而温度降至20℃的秋季也有可能发生褐潮,并持续到寒冷的冬季(0℃)[20].分子检测发现,辽东湾全海域都有分布,生态风险较高.

金牛微球藻与抑食金球藻在辽东湾的分布相似,春、夏季密度较高,秋、冬季未检出,说明温度是影响该藻繁殖的主要因素.虽然该藻为单细胞绿藻,但无法被贝类食用,春、夏季正是养殖贝类摄取营养季节,若暴发褐潮,将与抑食金球藻影响相似,因此该藻的生态灾害风险较高[21].

细小微胞藻在辽东湾广泛分布,春、夏、秋季密度较高,冬季较少.普通小球藻、密球藻、钙质角毛藻在辽东湾广泛分布,但密度不及细小微胞藻,夏季密度相对较高,秋、冬季较少.微拟球藻和颗粒微拟球藻在辽东湾的分布范围较小,密度较低,冬季未检出,说明都是温度依赖型.这6种潜在褐潮藻尚未报道对海洋生物的毒害作用,可见生态灾害风险较低.

3.4 褐潮生物环境关联

由于注释到种的褐潮生物较少,研究区域各环境因子差异不大,RDA排序分析时褐潮生物密度与环境因子相关性不高,仅与夏季无机氮、秋季水深和N/P,冬季水温显著相关.也可能与褐潮生物生长密切相关的环境因子未获分析导致.

辽东湾浮游植物群落演替受水体中理化环境因子的综合影响[22-23],春季水温和无机氮是影响浮游植物群落结构的关键因子[24-25],而部分重金属(Hg、Pb)在一定程度上也会影响浮游植物群落结构的演替,微量金属元素之间的协同和拮抗作用显著地影响海洋浮游植物生长,Bruland等[26]研究认为,在远离近岸的外海大洋中,微量金属之间的拮抗作用可能是影响初级生产力的最主要因素.辽东湾夏季水温、N/P值和水深是影响浮游植物群落结构的关键因子,而同样部分重金属(Hg、Zn)等的浓度在一定程度上也会影响浮游植物群落结构的演替,例如,在低浓度环境条件下,Zn能促进海洋浮游植物的生长,但是过量会起到抑制作用;辽东湾秋季水温、COD、N/P值是影响浮游植物群落结构的关键因子,同样部分重金属(Cu、Zn)在一定程度上也会影响浮游植物群落结构的演替;辽东湾冬季水温和水深是影响浮游植物群落结构的关键因子,此时辽东湾海域水温整体处于全年低温期,水温将会限制浮游植物的生长繁殖,而不同水深将会影响浮游植物的垂直分布[10].由于辽东湾海域水体理化环境的多变性和年际差异性,往往会造成环境因子对浮游植物群落结构影响的差异性变化[27-28].

一般藻华都与富营养化有关,赤潮、绿潮等比较喜好无机营养盐[29-30],然而研究发现,褐潮更偏好有机营养盐.抑食金球藻拥有更多基因编码进行捕光活动,利用有机碳和有机氮以及金属元素所需的酶,可以使其在低光照、高浓度有机物和微量金属元素的浅海河口生态系统中与其他浮游植物竞争,从而引发褐潮.在磷胁迫条件下,抑食金球藻随即利用碱性磷酸酶水解有机磷满足其生长繁殖.水温是褐潮暴发的主要控制因子,20℃左右较适宜褐潮藻增殖,水温高于25℃则不利于增殖[1].

4 结论

4.1 根据藻类粒径统计分析结果,辽东湾潜在的褐潮生物有8种:抑食金球藻、金牛微球藻、微拟球藻、颗粒微拟球藻、细小微胞藻、密球藻、普通小球藻、钙质角毛藻,前2种生态风险较高,主要分布在辽东湾西南、东南两侧,应引起重视.

4.2 细小微胞藻丰度最高(平均161445个/L),主要分布在秋季;其次是抑食金球藻、金牛微球藻(平均13912,13717个/L),主要分布在春季;之后为钙质角毛藻、普通小球藻(平均5498,5234个/L),主要分布在秋季;密球藻(平均1345个/L),主要分布在夏季;微拟球藻、颗粒微拟球藻最少(平均56,44个/L),冬季无分布.

4.3 辽东湾潜在褐潮生物丰度与水温、水深、无机氮、N/P相关显著,其群落结构演替与环境因子关联性有待于进一步发掘.

[1] 宋 伦,毕相东.渤海海洋生态灾害及应急处置 [M]. 沈阳:辽宁科学技术出版社, 2015:175-210.

[2] Song Lun, Yang Guojun, Wang Nianbin, et al. Relationship between environmental factors and plankton in the Bayuquan Port, Liaodong Bay, China: a five-year study [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2016,34(4):654-671.

[3] 乔 玲,甄 毓,米铁柱.抑食金球藻()褐潮研究概述 [J]. 海洋环境科学, 2016,35(3):473-480.

[4] 刘卫东,宋 伦,吴 景.环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化[J].生态学报, 2017,37(12):4208-4216.

[5] Kong Fanzhou, Yu Rencheng, Zhang Qingchun, et al. Pigment characterization for the 2011 bloom in Qinhuangdao implicated "brown tide" events in China [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2012,30(3):361-370.

[6] Amaral Z L, Artigas L F, Baross J, et al. A global census of marine microbes.life in the world′s oceans: diversity,distribution and abundance [M]. Oxford: Blackwell Publishing Ltd., 2010:223-245.

[7] 于 杰.浮游生物多样性高效检测技术的建立及其在渤海褐潮研究中的应用 [D]. 青岛:中国海洋大学, 2014.

[8] 宋 伦,吴 景,刘卫东,等.渤海长兴岛海域微型和微微型浮游植物多样性 [J]. 环境科学研究, 2016,29(11):1635-1642.

[9] 宋 伦,吴 景,宋永刚,等.褐潮致灾种抑食金球藻在辽东湾的分布 [J]. 环境科学研究, 2017,30(4):537-544.

[10] 宋 伦,宋广军.辽东湾浮游植物生态特征研究 [M]. 沈阳:辽宁科学技术出版社, 2016:437-440.

[11] GB/T 12763-2007 海洋调查规范 [S].

[12] GB17378-2007 海洋监测规范 [S].

[13] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P,et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools [J]. Nucleic Acids Research, 2013,41:590-596.

[14] Rao Fu, Jun Gong. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology [J]. Journal of Eukaryotic Microbiology, 2017,64:885–896.

[15] DB21/T 2427-2015 海洋褐潮监测技术规程 [S].

[16] Xu X, Yu Z, Cheng F, et al. Molecular diversity and ecological characteristics of the eukaryotic phytoplankton community in the coastal waters of the Bohai sea, China [J].Harmful Algae,2017,61: 13-22.

[17] 王雪芹,王光华,乔 飞,等.高通量测序及其在食物网解析中的应用进展 [J]. 生态学报, 2017,37(8):2530-2539.

[18] 孙 军,刘东艳,钟 华,等.浮游植物粒级研究方法的比较 [J]. 青岛海洋大学学报, 2003,33(6):917-924.

[19] 宋 伦,宋广军,王年斌,等.辽东湾网采浮游植物粒级结构的胁迫响应[J]. 中国环境科学, 2015,35(9):2764-2771.

[20] Nuzzi R, Waters R M. Long-term perspective on the dynamics of brown tide blooms in Long Island coastal bays [J]. Harmful Algae, 2004,3(4):279-293.

[21] 江雪娇.北黄海微微型浮游植物的丰度及微微型真核浮游生物分子多样性研究 [D]. 青岛:中国海洋大学, 2009.

[22] 宋 伦,王年斌,宋永刚,等.辽宁近岸浑浊海域网采浮游生物的粒径结构特征 [J]. 应用生态学报, 2013,24(4):900-908.

[23] 宋 伦,周遵春,王年斌,等.辽东湾浮游植物多样性与海洋环境的关系 [J]. 海洋环境科学, 2007,26(4):365-368.

[24] 张玉凤,田 金,杨 爽,等.大连湾海域营养盐时空分布、结构特征及其生态响应 [J]. 中国环境科学, 2015,35(1):236-243.

[25] 李清雪,陶建华.应用浮游植物群落结构指数评价海域富营养化 [J]. 中国环境科学, 1999,19(6):548-551.

[26] Bruland K W, Orians K J, Cowen J P. Reactive trace metals in the stratified central North Pacific [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1994,58(15):3171-3182.

[27] 邓春梅,于志刚.东海、南黄海浮游植物粒级结构及环境影响因素分析 [J].中国海洋大学学报, 2008,38(5):791-798.

[28] 焦念志,海洋微型生物生态学 [M]. 北京:科学出版社, 2006.

[29] 叶 然,刘 莲,王 琼,等.春季浙北海域浮游植物群落的空间分布[J]. 中国环境科学, 2017,37(4):1492-1504.

[30] 王 华,杨树平,房晟忠,等.滇池浮游植物群落特征及与环境因子的典范对应分析[J]. 中国环境科学, 2016,36(2):544-552.

The temporal and spatial distribution of potential brown tide species and correlation analysis with environmental factors in Liaodong Bay.

SONG Lun1,2, WU Jing2, LI Nan2, DU Jing2, YANG Shuang2, WANG Peng1*

(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, School of Environment, Harbin Institute of Technology, Haerbin 150090, China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China)., 2018,38(8)：3060~3071

To gain an improved understanding of the mechanisms and species that drive brown tides, we used the V4region of 18S rDNA as the target gene to design the V4(F/R) primer and evaluated the diversity of the composition and relative abundances of the eukaryotic phytoplankton community in Liaodong Bay in different seasons with high-throughput sequencing technology. We found that some of the species in Liaodong Bay, such as,,sp.,,,,,and., had the potential to cause brown tides. Of these species, the risks were higher fromand, which aredistributed in the southwest and southeast of the bay, respectively.andlive with mixotrophs and other six potential brown tide species live with autotrophs.The abundance ofwas the largest, withan average of 161445 ind/L, mainly occurring in autumn.and, with average abundances of 13912 and 13717 ind/L over the four seasons,respectively, mainly occurring in spring.and, with average abundances of5498 and 5234 ind/L, respectively, were most abundant in autumn.. andwere absent in the winter and were present at only low abundances in other seasons. The correlations between the abundances of the brown tide species and environmental factors, such as the water temperature, water depth, N/P ratio, and inorganic nitrogen content, were significant. And the relationship between community structure succession and environmental factors need to be studied further.

brown tide species；ecological distribution；environmental correlation；liaodong Bay

X171.1

A

1000-6923(2018)08-3060-12

宋 伦(1980-),男,辽宁大连人,副研究员,硕士,主要从事海洋生物生态学研究.发表论文60余篇.

2018-01-10

国家自然科学基金资助项目(51779066);中国海洋发展研究会重大项目资助(CAMAZDA201605);辽宁省海洋与渔业科研项目(201710);大连市高层次人才创新支持计划-青年科技之星项目(2016RQ080)

* 责任作者, 教授, pwang73@vip.sina.com